[发明专利]转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品种的检测方法，具体涉及转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

国际农业生物技术应用服务组织近期发表的《2010年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》报告显示，由于转基因作物带来的巨大益处，过去15年内大约有1亿人次的农民做出种植决定。自转基因作物投入商业化种植15年来，全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年，全球29个国家的1540万农民种植了共1.48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了100万公顷。这些国家按照作物种植面积的大小排列分别是：美国（6680万公顷）、巴西（2540万公顷）、阿根廷（2290万公顷）、印度（940万公顷）、加拿大（880万公顷）、中国（350万公顷）、巴拉圭（260万公顷）、巴基斯坦（240万公顷）、南非（220万公顷）和乌拉圭（110万公顷）。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，全球约三分之一以上的人口以水稻为主食。 同时，水稻也是受害虫侵袭最为严重的粮食作物之一. 据不完全统计，全世界每年因虫害造成的损失占水稻总产量的5%以上，约为1×10⁶ t 。特别是近年来，二化螟等蛀茎害虫的发生逐年加重，对水稻生产造成严重威胁。传统化学防治方法的长期使用，不但增加生产成本，造成环境污染，而且破坏了生态平衡，因此选育抗虫水稻是防治害虫最经济、有效的方法，随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用基因工程将外源抗虫基因导入水稻，使水稻自身产生抗虫蛋白从而达到防治害虫的目的已成为现实。

目前，国内外已培育出多个高抗水稻螟虫（Cnapha locrocis medinalis）的转抗虫基因材料，如转Bt基因水稻。Bt基因是一种革兰氏阳性芽抱细菌苏云菌杆菌（Bacillus thuringiertsis Bt）杀虫晶体蛋白基因的简称，目前Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种应用中最广泛的抗虫基因。但是由于转入的外源基因并非来自传统的基因库，转抗虫基因植物可能带来生态效应和环境风险问题已成为国际社会关注的焦点。

1993年，联合国经济发展与合作组织（OECO）提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9%。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1～5%不等。

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。

为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。

转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量，目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质（基因表达产物）和是否含有外源基因（DNA）。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法（ELISA）试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用与目的蛋白（抗原）特异性结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthernblot)，PCR检测技术。其中PCR检测方法是最主要，最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，竞争性定量PCR方法，荧光定量PCR方法等等。