[发明专利]芽孢杆菌利用玉米秸秆水解液生产聚合级L-乳酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵生产L-乳酸的方法，特别涉及一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)利用玉米秸秆水解液生产L-乳酸的方法。

背景技术

乳酸(Lactic acid：CH₃CHOHCOOH/C₃H₆O₃)广泛应用于食品、纺织、化妆与医药等行业，有可能替代目前的石化产品，如丙烯酸，或能形成新的生物制品，如聚乳酸。乳酸的需求量随着运用范围的增大而日益增加。可以通过合成和发酵两个途径形成乳酸。合成法是用乙醛和剧毒物氢氰酸作为底物，因此不能广泛应用于食品中，并且合成法最终产生一种消旋混合物，还需进行光学拆分，稍显复杂。相比，发酵法比较常用，它可以产生手性纯度接近100％的D型或L型乳酸，这两种异构体都能够聚合，但是立体纯度的聚合特性不同。发酵法还可分为同型发酵和异型发酵，但是商业化生产却是通过同型分批发酵模式生产的。有人曾尝试用根霉菌通过异型发酵或嗜热条件产乳酸，事实证明这并不经济。

现有研究已经证明许多微生物有生产乳酸的能力，包括乳酸菌、真菌和各种基因改造的菌株。其中嗜热芽孢杆菌是一种新型的生产乳酸的菌种。目前普遍把精制糖作为原料生产乳酸，但是价格比较昂贵，不利于降低乳酸生产成本。由于制备L-乳酸近70％的成本是其生产原料，因此急需找到经济上有吸引力的农业废料作为碳源和廉价的氮源，以满足对营养物质要求比较苛刻的微生物生长及产乳酸。玉米秸秆是玉米收获后在玉米地里的农业残留，在中国大量存在。玉米秸秆主要含木质纤维素，由纤维素和半纤维素组成，分别彻底水解为葡萄糖和木糖。许多生产乳酸的微生物可以利用葡萄糖，但是又能同时利用木糖的微生物几乎很少。如果能以玉米秸秆水解液作为发酵生产L-乳酸的底物，将具有广阔的市场前景。从工业长远发展的角度看，经济节约发酵成本的关键性步骤就是选择廉价的农副产品为碳氮原，并优化选择其生产乳酸的最适廉价碳氮原浓度。如果能以可再生性农业废料作为原料来发酵，高效利用廉价底物生产光学纯的L-乳酸，将具有较高的经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产L-乳酸的方法。

本发明所提供的发酵生产L-乳酸的方法包括如下步骤：将芽孢杆菌(Bacillus sp.)接种到以玉米秸秆水解液作为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵培养，得到L-乳酸。

所述玉米秸秆水解液可为玉米秸秆的酸水解液，也可为酶水解液，还可为酸酶联合水解液；在本发明中，所述玉米秸秆水解液为玉米秸秆的酸水解液，其中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量比可为(27-29)∶(8-10)∶1，具体如28∶9∶1。

所述玉米秸秆水解液中总还原糖在所述发酵培养基中的终浓度可为82-134g/L，如82.53g/L。

在本发明中，所述玉米秸秆水解液中所述总还原糖为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖；所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度具体为69.4g/L，所述木糖在所述发酵培养基中的终浓度具体为21.7g/L，所述阿拉伯糖在所述发酵培养基中的终浓度具体为2.5g/L。

所述发酵培养基中含有碳源，氮源和控制发酵液pH的中和剂。在本发明的实施例中，所述碳源即为上述玉米秸秆水解液；所述氮源为终浓度为9.8-13.2g/L，如9.87g/L的花生粕，所述花生粕中需加入终浓度为60000U/L的中性蛋白酶；其中，中性蛋白酶的酶活定义为：在测定条件(30±0.2℃；pH值7.5)下，每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长的吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位(即1U)，用U/g表示。所述中性蛋白酶用于处理花生粕，释放氮元素。在本发明的一个实施例中，所述中性蛋白酶具体为诺维信(中国)生物技术有限公司产品，CAS号为9068-59-1。所述中和剂为碳酸钙；所述碳酸钙在所述发酵培养基中的含量可为所述总还原糖质量的60％。所述发酵培养基的pH可为5.1-6.5，如6.5。

所述发酵培养的温度可为45-55℃，具体如50℃；所述发酵培养的培养方式可为静止培养；所述发酵培养的时间可为72-96h，具体如96h。