[发明专利]检测维生素C生产菌株传代培养过程中营养环境变化的方法

权利要求书

1.一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48h；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡混菌培养，以24-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-4个时间取样，取3-4个样；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48h；再分别转入新的种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中；

④发酵：

将步骤(1)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养10-15h；

(2)营养环境中物质的测定：

①培养液的收集：

分别取步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液1-2mL，以5000-10000rpm的转速离心，收集上清，并用0.22μm纤维素微孔滤膜过滤，得滤液；

②样品制备：

取步骤(2)①获得的滤液10-50μL置于离心管中，加入50-200μL的0.04-0.14mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40-100μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应30-60min；

③GC-TOFMS检测：

将1μL步骤(2)②获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为250℃-280℃，载气为高纯氦气，流速0.6-0.8ml/min，分流比3∶1-20∶1，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃，保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI电离源，源温230℃-260℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；

(3)主成分分析：

①将步骤(2)获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；

②用Metlab 7.0(Mathworks.Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到差异营养环境标志物；

(4)过程分析

将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中营养环境的变化。