[发明专利]紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及溶菌酶，具体涉及紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法。

背景技术

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）是无脊椎动物体内非常重要的固有免疫因子之一，它主要通过切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，使细胞胀裂从而引起细菌裂解。溶菌酶在机体免疫应答过程中不仅能直接杀死细菌，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。溶菌酶按照其来源可分为六类：C（chicken）型、G（goose）型、I（invertebrate）型、植物型、细菌型和T4噬菌体型溶菌酶。G型溶菌酶主要存在于哺乳动物、鸟类和鱼类中，专利号为CN 2004100506518及2004100506522 从扇贝中获得了G型溶菌酶，而I型溶菌酶只存在于无脊椎动物中，C型溶菌酶大都来自于脊椎动物。由于C型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抑制和灭杀作用，在较低温度条件下活性较高且具有较强的热稳定性，因此在作为水产饲料添加剂和水产品保鲜剂方面具有很好的应用前景。目前，针对C 型溶菌酶已开展较多研究，发现其通常含有 130个左右的氨基酸残基，具有4 对二硫键，三维结构呈较紧密的椭球。研究发现，Glu³⁵、Asp⁵²及Trp⁶²残基是C型溶菌酶活性的必需氨基酸残基，Asp¹⁰¹、Arg^ll4、Trp¹⁰⁸等残基对“底物-酶复合物”的形成也发挥着重要作用 (Muraki M，et a1，1997)。近期研究发现，鲍鱼、三疣梭子蟹等无脊椎动物也存在C型溶菌酶，并且该类型的C型溶菌酶具有较强的抑制革兰氏阴性菌活性。迄今为止，尚未有关于紫贻贝C型溶菌酶及其抗菌活性的研究报道。

发明内容

本发明提供了紫贻贝C型溶菌酶及表达基因，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该紫贻贝C型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抗菌作用。

本发明还提供了紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，该制备方法能得到纯度较高的紫贻贝C型溶菌酶。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为紫贻贝C型溶菌酶，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。表达该紫贻贝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，其步骤如下：

1）总RNA提取：用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于-80℃备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；

2）mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；

3）cDNA模板制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒（购于Stratagene公司）将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA经末端补平、EcoR I 接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒（购于QIAGEN公司）对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体（购于Invetrogen公司）连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒（购于Stratagene公司）对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜（DMSO），得到含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；测序该C型溶菌酶表达基因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；