[发明专利]一种检测黄病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂及方法

说明书

技术领域

本发明涉及黄病毒的检测技术，具体涉及一种检测黄病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂及方法。

背景技术

黄热病毒属病毒（Flavivirus）简称黄病毒，是黄病毒科的最大家族，已知由70多种病毒构成，其中40多种病毒与人类疾病相关,包括登革病毒（DENV）、乙型脑炎病毒（JEV）、蜱传脑炎病毒（TBEV）、西尼罗病毒（WNV）、Kujun 病毒（KUN）、圣路易斯脑炎病毒和黄热病毒（YFV）等，其中大多数为虫媒病毒。近年来，以登革热病毒、日本脑炎病毒(乙型脑炎病毒)以及西尼罗病毒等为代表的黄病毒疫源地的不断扩大，已成为全球性的公共卫生问题。现有病原体检测技术体系和方法大多为单一病原的常规检测技术，如公开号为CN101629215A的发明专利申请，就公开了检测乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒的多重试剂盒，利用各自的特异性引物对上述3种病毒进行检测。也有如授权公告号为CN100557027C的发明专利，公开了检测日本脑炎病毒血清群成员（JEV、WNV、圣路易斯脑炎病毒、KUN和河谷脑炎病毒）的试剂盒和方法，该试剂盒针对也仅是日本脑炎病毒血清群成员的试剂，不能检测出黄热病毒和蜱传脑炎病毒等其它的黄病毒属病毒。CODEHOP RT-PCR技术是一种可用于未知病原体检测的新技术，该技术依据病毒家族共有的保守蛋白氨基酸序列，通过专业软件，设计特定引物。当怀疑一种未知病原体为某病毒或细菌家族的成员，或一个未知基因是某基因家族成员时，可以用该技术进行验证。目前尚未有应用该技术对黄病毒属病毒群进行检测的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测黄病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂及方法，该检测试剂和方法为黄病毒属病毒通用检测试剂和检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测黄病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂，包括10×PCR缓冲液、MgCl₂溶液、dNTP液、Taq酶液、上游引物溶液和下游引物溶液，所述上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物B1，所述下游引物溶液含有核苷酸序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc的引物B2；其中r为嘌呤，可以是g或a，y为嘧啶，可以是c或t/u，n是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它。

利用上述试剂具体检测黄病毒属病毒的方法的步骤如下：

a、RNA提取：用RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行； 

b、RNA逆转录：用RNA逆转录试剂盒（购于Promega公司）对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行：在0.2mL eppendorf管中加入oligo d(T)₁₅ primers（50μM） 1μL，上述约RNA 10μL，72℃ 10.min ，加入5×RT buffer 4μL、dNTP液（10mM）1μL、AMV反转录酶液（10U/μL）1μL、RNA酶抑制剂(20U/μL) 0.5μL、无RNA酶水 1.5μL，42℃ 1h，72℃ 10min；反应产物即为后续的PCR模板；

c、PCR反应：在0.2mL eppendorf管中加入10×PCR buffer 2.5μL、浓度为25mM的 MgCl₂溶液1.5μL、浓度为10mM的 dNTP液0.5μL、浓度为5U/μL的 Taq酶液 0.5μL、浓度为25μM上游引物溶液1μL、浓度为25μM下游引物溶液1μL，上述PCR模板2μL，灭菌去离子水16μL组成的反应体系；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃ 延伸1min，45个循环，72℃延伸7min，4℃保存PCR产物，上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物B1，下游引物溶液含有核苷酸序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc的引物B2； 

d、琼脂糖凝胶电泳：将上述PCR产物用重量百分浓度1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现421~445bp大小片段的条带，则为黄热属病毒。