[发明专利]五节芒快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程领域，涉及植物组织工程技术，具体地说是一种五节芒的组织快繁方法。

背景技术

五节芒(Miscanthus floridulus)属于禾本科(Poaceae)芒属(Miscanthus Andersson)(陈守良，1997)，是一种高光效的C4植物，具有生物质产量高、抗逆性强、纤维素含量高、燃烧充分等特点，被认为是一种开发潜力巨大的生物质能源植物，在我国主要分布在热带和亚热带地区(萧运峰，1995)。目前，五节芒在组织培养有少量报道，胡恒康等(植物生理学通讯，2009)利用种子为外植体，萌发的小苗切去胚根诱导出丛生芽。刁英等在一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法中，以幼穗为外植体，诱导胚性愈伤组织，幼穗取材长度及消毒方法与本发明不同，并且本发明诱导愈伤组织过程中使用的培养基等均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种五节芒的快速繁殖方法。

五节芒快速繁殖方法，包括如下步骤：

1)外植体的选择与灭菌：选用五节芒的幼穗，将幼穗外包裹的多层叶或叶鞘去除，仅保留幼穗外的旗叶，用无菌水清洗3～4次后，在无菌操作台上用70％酒精处理15-30秒，再用0.1％的升汞消毒18～20分钟，用无菌水冲洗6～7次备用；

2)胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后带旗叶的幼穗，在超净台剥去旗叶，将幼穗切成穗段，接种在MS+2.0-6.0mg/L 2，4-D+0-0.2mg/L 6-BA的愈伤组织诱导培养基；在250-300lux光照下培养，保持温度24±2℃，诱导产生愈伤组织；(6-8天左右产生愈伤组织)；

3)丛生芽诱导及增殖：愈伤组织接种在MS+1.0-4.0mg/L 6-BA的分化培养基；在2000lux光照下培养，保持温度24±2℃，直至形成丛生芽；增殖系数为4以上；

4)生根培养：以MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根。生根率达95％以上。

步骤1)中所述外植体的选择取幼穗时叶枕距为0-2cm。

步骤1)中所述的外植体选用五节芒处于颖花原基形成期的幼穗。

步骤2)中将幼穗切成0.3-0.5cm长度的穗段。

步骤2)中接种瓶(5.6×6.9×9.1cm(口径×胸径×高))内每瓶接种2-5个穗段。

步骤3)中愈伤组织生长至直径0.5-0.8cm，挑选淡黄色并致密的愈伤组织，接种在分化培养基。

本发明提出的五节芒的组织培养方法，采用幼穗外植体，保证了遗传稳定性；避免幼穗直接与酒精和升汞接触，以免幼穗褐化，降低出愈率；同时，本发明方法仅需35天左右形成完整植株，3～5个月内可获得大量完整植株。

附图说明

图1为五节芒幼穗诱导愈伤组织的图片；

图2为五节芒胚性愈伤组织分化的图片；

图3为五节芒增殖培养的图片；

图4为五节芒生根培养的图片。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。

实施例1

取材：五节芒(M.floridulus)02117采自湖南郴州，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃内。

1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒优良单株，切取叶枕距为0的处于颖花原基形成期的幼穗。首先将幼穗外部叶清除干净，仅留旗叶，用无菌水清洗3次后，在无菌操作台上用70％酒精处理15秒左右，再用0.1％的升汞消毒18分钟，用无菌水冲洗6次备用；

2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后带旗叶的幼穗，在超净台上去除旗叶，将幼穗切成0.3cm左右的穗段，接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D2.0mg/L+6-BA0.1mg/L。接种瓶内每瓶接种5个穗段，在培养室下300lux光照，保持温度24±2℃，培养7天左右诱导出愈伤组织；

3、丛生芽诱导及增殖：愈伤组织生长至直径为0.5cm左右，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在MS+6-BA2.0mg/L的分化培养基。在2000lux光照下培养，保持温度24+2℃，直至形成丛生芽，增殖系数为4.6以上；在生根培养基：MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/LIBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根，生根率达95％以上，只需35天左右形成完整植株；