[发明专利]增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组腺相关病毒，尤其涉及增加腺相关病毒(adeno-associated virus)靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒，本发明还涉及该重组四质粒腺相关病毒在建立病毒投递系统以及在组织工程学中的应用，属于重组腺相关病毒及其应用领域。

背景技术

基因治疗从基因角度是用正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法，从治疗方面是将新的遗传物质转移至某个体的细胞内使其获得治疗效果。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。从二十世纪八十年代末，美国国家卫生研究院的安德生(FrenchAnderson)、布里茲(Michael Blaese)、罗森堡(Steven Rosenberg)等科学家共同提出基因治疗的临床实验申请。到今日，可用于主要包括单基因遗传病、肿瘤、心血管疾病、神经疾病和其他如传染类疾病的各期临床治疗阶段，基因治疗已取得巨大的成就，但是其本身仍存在缺乏高效传递系统，缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题，针对与这些方面的策略改进，成为近来的研究热点。

病毒具备高效转导宿主细胞的能力，因而利用基因工程制备的重组病毒载体在针对多种疾病的基因治疗，尤其是单基因酶缺陷型遗传疾病的替代治疗中，成为携带外源目的基因在靶向组织中高效表达的重要手段。目前用于基因治疗的重组病毒载体主要包括腺病毒(adenovirus，Ad)、反转录病毒(retrovirus，RV)、慢病毒(lentivirus，LV)、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)及单纯疱疹病毒(herpes simplex-virus，HSV)等，而其中的腺相关病毒因其无致病性、低免疫反应性、感染宿主谱广泛、转基因表达长效等优势，成为在基因治疗成为应用前景最好的载体之一。但AAV基因组存在包装容量有限、对多数组织转导率不尽如人意等主要缺点，成为困扰AAV在临床应用中的瓶颈问题。

应用现代分子生物学的手段对AAV进行改良，一直是主要的研究热点。随着AAV不同血清型的发现以及不同亚型的表面结合受体和组织感染嗜性的相对特异性，为不同靶向组织的基因治疗中寻求最佳的载体类型与组合，以及基因重组技术对AAV衣壳蛋白的改造提供了新的思路和方向。

组织工程是为达到组织重生用来创建人工器官的一种手段，它所涉及的领域从材料工程一直延伸到生命科学。一种优良的支架材料必须具备以下优点：(1)有易于设计和修饰的基本单元。(2)良好的生物相容性，无毒，无抗原性和无致癌性。(3)适当的生物降解性，降解产物可以被生理系统清除。(4)具有能特异促进或抑制细胞-材料相互作用的特性。(5)材料的生产、纯化和处理是容易的并可升级。(6)有与水溶液和生理条件的化学相容性。其中任何一点都会限制支架材料的潜在应用。近年来，医用生物性可吸收材料在临床上得到广泛的应用。它主要包括天然材料和合成高分子材料两大类。天然材料包括胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，明胶等。高分子材料如聚乳酸类，聚乙烯，聚氨酯等。这些材料虽然在临床应用广泛，但是也具有如降解速度难以控制，吸收性差，与周围组织相容性差等缺点。

针对这些缺点，研究人员提出了不同的研究策略。目前针对可吸收性材料的研究方向主要为：对于组织工程支架的改性和复合，改善现有材料的不足。可以通过支架上复合蛋白，也可以将基因整合与支架上。目前多采用质粒携带基因，但这种策略最大的弊端就是感染效率低下，局部作用特异性差，很难达到理想的治疗效果。

综上所述，构建一株能够有效增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒对于基因治疗的临床应用以及组织工程材料的制备等方面将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株有效增加腺相关病毒靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒；

本发明的目的之二是提供一种构建所述增加腺相关病毒靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒的方法；

本发明目的之三是将所构建的重组四质粒腺相关病毒应用于构建病毒投递系统及组织工程学支架材料等方面。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株增加腺相关病毒靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒(FLAG-AAV.Luc)，该重组四质粒腺相关病毒含有经过改造的腺相关病毒VP2蛋白以及腺相关病毒原始的VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述的经过改造的腺相关病毒VP2蛋白是腺相关病毒原始的VP2衣壳蛋白的N末端插入一段FLAG标签序列；所述的编码腺相关病毒原始的VP2衣壳蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述的FLAG标签序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。