[发明专利]一种利用家蚕生物反应器生产猪瘟病毒亚单位疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及利用基因工程手段在家蚕体内大量表达猪瘟病毒重组E2蛋白及利用该重组蛋白制备猪瘟重组亚单位疫苗的方法及产品。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的，呈急性或慢性经过，病死率高，其病理特征是小血管壁变性，内脏器官多发性出血、梗塞、坏死，是一种危害性极大的猪传染病。

中国专利CN101736017A公开了一种使用重组家蚕杆状病毒(BmNPV)生产猪瘟病毒E2蛋白的方法，使用BmNPV感染家蚕幼虫或蚕蛹表达外源蛋白(CSFV E2蛋白)，即通过构建重组BmNPV，然后感染家蚕幼虫或蚕蛹，以表达E2蛋白。但是上述使用BmNPV表达系统感染家蚕的方法，重组BmNPV病毒的构建步骤繁琐；而且BmNPV重组病毒还需要在家蚕细胞上通过多轮空斑筛选进行重组病毒筛选，工艺和步骤较为繁复，且家蚕细胞培养周期长，培养困难，技术要求较高，并有很高比例的假阳性的出现。此外，使用重组BmNPV感染家蚕有时会引起家蚕的剧烈的症状，导致蚕体或蚕蛹过早死亡而引起蚕体腐败等问题，产生的重组蛋白的产量和质量不稳定。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用家蚕幼虫和/或蚕蛹等家蚕生物反应器来表达猪瘟病毒重组E2蛋白的方法，是通过基因工程技术将猪瘟病毒E2基因及其上游90个核苷酸序列重组入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的基因组上，获得重组的AcNPV，通过将上述重组病毒注射家蚕或蛹来表达猪瘟病毒重组E2蛋白。

本发明的另一主要目的在于通过上述重组猪瘟病毒重组E2蛋白生产猪瘟亚单位疫苗的方法及其产品，包括猪瘟亚单位E2蛋白抗原、免疫佐剂。

技术方案

为了实现上述目的，本发明采用以下技术手段：

一种猪瘟病毒E2蛋白，所述猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO1.所示序列，其中包括猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列与猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列上游30个氨基酸。

本发明所述的猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列可以在一定范围内进行修饰、改变，所获得的修饰后的蛋白质或蛋白质的片段与猪瘟病毒重组E2蛋白有相同的生物学功能与抗原活性。对蛋白质进行修饰和改变的方法为本领域常规的方法，为本领域普通技术人员所熟悉。按照现代基因工程技术理论，氨基酸序列同源性70％以上的蛋白质在生物学中被认为是具有相同生物学功能的蛋白质。在此范围内对蛋白质氨基酸序列进行的修饰和突变，如点突变、插入或缺失或插入功能性片段等，均被认为并未改变蛋白质本身的生物学特性，也不会改变蛋白质的免疫原性。因此，通过本领域常用的方法获得的与本发明所述的重组蛋白有至少70％同源性的蛋白质或免疫性片段都具有与本发明所述猪瘟病毒重组E2蛋白相同的生物学特性或免疫活性，都在本发明的保护范围之内。

优选地，本发明所述的猪瘟病毒重组E2蛋白为具有与SEQ ID NO1.序列至少70％同源性的序列；更优选地，为具有与SEQ ID NO1.序列至少80％同源性的序列；更优选地，为具有与SEQ ID NO1.序列至少90％同源性的序列；最优选地，猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO1.所示序列。

本发明还提供一种猪瘟病毒重组E2蛋白，所述猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO2.所示序列，本发明还提供具有与SEQ ID NO2.序列至少70％同源性的序列。更优选地，为具有与SEQ ID NO2.序列至少80％同源性的序列；更优选地，为具有与SEQ ID NO2.序列至少90％同源性的序列；最优选地，猪瘟病毒重组E2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO2.所示序列，所述SEQ ID NO2.序列即为猪瘟病毒C株的E2蛋白。

本发明还提供了利用家蚕生物反应器生产猪瘟病毒重组E2蛋白的方法，包括以下步骤：

1)克隆猪瘟病毒E2蛋白的编码基因序列，至昆虫核型多角体病毒(AcNPV)的表达转移载体pFastBacI上，获得重组表达转移载体；

2)将重组表达转移载体转化入含有杆状病毒载体的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，获得含有猪瘟病毒E2基因的重组杆状病毒基因组穿梭载体；

3)将上述重组杆状病毒基因组穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得带该猪瘟病毒E2基因的重组昆虫核型多角体病毒；