[发明专利]一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法。

(二)背景技术

经典的基因克隆以及重组实验是以II型限制性内切酶以及T4DNA连接酶为基础的。利用限制性内切酶特异性地识别并酶切DNA，然后用T4DNA连接酶将不同DNA片段连接在一起，从而达到基因克隆和重组的目的。这种方法存在着一些问题：首先，并不是所有的基因都存在合适的酶切位点，尤其是有些载体的克隆位点只有少数几个内切酶可供选择的情况下；其次，用限制性内切酶克隆或重组后，会留下不必要限制性内切酶序列痕迹，多数情况下这些限制性内切酶的识别序列随后也会导致我们目的蛋白上多出一些氨基酸序列，这些多余的氨基酸可能会改变目的蛋白的结构以及活性，进而影响实验结果。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种不依赖酶切位点和连接酶的克隆及重组DNA的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法，所述方法是在待插入的目的基因两端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10～30bp(15bp左右为宜)的DNA片段后与载体DNA在外切核酸酶作用下进行重组，即在制备目的基因片段时，在扩增引物的5’端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10～30bp(15bp左右为宜)的DNA片段。

所述方法包括：

(1)载体DNA制备：以目的基因插入位点对应的限制性内切酶对纯化的克隆载体质粒进行酶切；或者以稀释的克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，上游引物记为primer1(约15bp)，下游引物记为primer2(约15bp)，进行PCR扩增；

(2)目的基因制备：在目的基因原始扩增引物的5’端分别加上primer1和primer2的反向互补序列，所得引物以含有目的基因的DNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因；

(3)基因重组：将步骤(1)载体DNA和步骤(2)目的基因混合，加入Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶或λExonuclease，进行反应获得重组DNA。

(4)转化：将步骤(3)所得的重组DNA转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含有目的基因质粒的大肠杆菌克隆。

优选的，步骤(3)所用聚合酶为T4DNA聚合酶。

具体的，以所述目的基因为SGK2(serum/glucocorticoid regulated kinase 2)基因的ORF，所述克隆载体为pBlueScript II KS(-)，插入位点为EcoR V酶切位点为例，所述方法如下：

(1)载体DNA制备：以稀释的克隆载体质粒为模板，以引物primer1.1和primer2.1进行PCR扩增，得到载体DNA；

引物primer1.1序列如下：5’-ATCGAATTCCTGCAGCC-3’；

引物primer2.1序列如下：5’-AATCAAGCTTATCGATACCG-3’；

(2)目的基因制备：以小鼠脊髓cDNA为模板，用引物SGK2F和SGK2R进行PCR扩增，得到目的基因；

引物SGK2F序列如下：

5’-GGCTGCAGGAATTCGATGGCCTCCAGCCCAGTTG-3’

引物SGK2R序列如下：

5’-CGGTATCGATAAGCTTGATCAAGAGTCCAAAATGTCATCATC-3’

(3)基因重组：将步骤(1)载体DNA和步骤(2)目的基因混合，加入T4DNA聚合酶，在20℃进行2min，然后70℃10min使酶失活，再50℃温浴30min进行退火；或加入Pfu DNA聚合酶，在50℃温浴30min进行酶切及退火；或加入λExonuclease，在37℃进行5min，然后70℃10min使酶失活，再在50℃温浴30min进行退火；即得重组DNA。

(4)转化：将步骤(3)所得的重组DNA转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含有目的基因质粒的大肠杆菌克隆。