[发明专利]细脚拟青霉人工培养方法及其制药用途

说明书

技术领域

本发明属于中药和天然药物技术领域，具体涉及细脚拟青霉人工培养方法及其制药用途。 

背景技术

细脚拟青霉[Paecilomyces tenuipes(Peck)Samson]是高雄山虫草(Cordyceps takaomontana Yakushiji＆Kumazawa)的无性型。研究表明，细脚拟青霉的主要化学组分如甾醇类、糖醇类、生物碱、有机酸类和微量元素与天然冬虫夏草十分相似，所含氨基酸种类亦相同，但是多种氨基酸却高出冬虫夏草。药理研究表明，细脚拟青霉在体外对乙型肝炎病毒、乙醇性肝损伤、肝纤维化，体内对四氯化碳急性肝损伤有很好的防护作用，且效果比同剂量的冬虫夏草更显著，因此认为细脚拟青霉可能是肝脏组织良好的保护剂或对治疗肝脏各种疾病具有较好的辅助作用。同时细脚拟青霉人工培养物来源简单易得，可以解决天然药用虫生真菌资源稀缺，生产周期长，产量低，质量不稳定等问题。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种细脚拟青霉人工培养方法，及其产物在制药中的用途。 

本发明一方面提供了一种细脚拟青霉人工培养方法，包括下列步骤： 

1）斜面菌种制备：将细脚拟青霉菌株接种到斜面培养基上，20～25℃下，培养7～10天；所述斜面培养基为PSA（马铃薯蔗糖琼脂培养基）、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)或YMB固体培养基。 

2）摇瓶种子液的制备：从步骤1）中制得的斜面上刮取菌丝接种到以PSB（马铃薯蔗糖液体培养基）或PDB（马铃薯葡萄糖液体培养基）为种子培养基的培养液中，24～26℃下，140～160rpm，培养3～5天即制得细脚拟青霉摇瓶种子液； 

3）将步骤2）中制得的摇瓶种子液按重量百分比为5%～10%接入灭菌后的PSB或PDB液体培养基为种子培养基的发酵罐中，24～26℃下，140～160rpm，培养1～2天即制得细脚拟青霉发酵罐种子液； 

4）将步骤3）中制得的发酵罐种子液按重量百分比为5%～10%接入灭菌后的固相培养基中，在温度为23～26℃，湿度为50～90%的条件下，静置封闭式培养30～35天；湿度优选为70-80%。 

5）采收。 

所述细脚拟青霉子实体的固相培养基的组分及各组分的重量份为： 

大麦            30-40 

H₂O             70-60 

用此种培养基培养出来的细脚拟青霉产量分别比用小米、小麦、大米、大麦加高粱、小麦加大麦为培养基培养的细脚拟青霉产量分别高90%、31%、200%、250%和30%。 

步骤1）所述菌株优选菌种保藏号为CGMCC NO.4176的细脚拟青霉菌株。此菌种为申请人从采集的鳞翅目幼虫感病体中分离纯化后筛选获得。 

该菌株已于2010年9月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4176，分类命名为：细脚拟青霉Paecilomyces tenuipes，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

经中国科学院微生物研究所形态特征鉴定，细脚拟青霉菌CGMCC No.4176的主要形态特征为： 

在马铃薯蔗糖琼脂培养基上菌落白色，致密，初期背面浅黄色，后期菌落上形成大量孢梗束，背面呈浅黄褐色。菌丝无色，分枝，平滑，具隔膜，宽1.5-3.0μm。分生孢子梗从菌丝上伸出，无色，平滑，分枝，长达110.0μm，宽达4.0μm。孢梗束白色至奶油黄色，长10-30厘米，产孢细胞瓶状，无色，2-6个簇生在孢子梗上呈帚状，顶部变细窄，5.0-8.0×2.5-3.2μm。分生孢子大部分圆柱形，部分椭圆形，也有腊肠形弯曲，单孢，无色，平滑，链生，5.0-6.7×2.0-2.5（3.0）μm。 

在查氏培养基上，灰白色，拱起，蓬松，绒毛状，孢梗束生长差或不长。在萨氏培养基上未见菌落生长。 

该菌生长最适温度为24-26℃，在pH 3-11之间均能够生长，但pH5.0-6.7之间生长最佳。在固体谷物培养基上发酵，菌苔灰白色，子实体（孢梗束）色泽鲜黄，生育甚佳，采收期30-40天。 

此菌培养产物通过分析表明，化学组分均含天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等；微量元素含钾、钙、镁、铁、锌、铜、 锰、镍、硒等；此外，多糖、腺苷、甘露醇、甾醇、有机酸和生物碱类与冬虫夏草活性成分上基本一致或超过冬虫夏草。