[发明专利]一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体是指使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活自然杀伤细胞(NK)的方法。

技术背景

NK细胞治疗对肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和急性白血病等肿瘤治疗有明显疗效。目前NK细胞治疗在美国主要用来和手术、化疗和放疗联合使用。NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量NK细胞非常困难。传统使用的高剂量白介素2激活生长倍数有限，端粒酶活性降低，扩增后的NK细胞杀伤功能低下。本公司之前的发明采用K562细胞转染跨膜IL-21和CD137复合物解决了这一问题。用该方法扩增的NK细胞纯度和活性显著增强，数量上可以达到临床治疗的需要。然而在肿瘤微环境(tumor microenvironment)中存在有大量的TAMs(肿瘤相关巨噬细胞)和CD19+B细胞，这些细胞为肿瘤细胞的生长提供营养因子。用仅转染跨膜IL-21和CD137复合物的K562细胞激活扩增的NK细胞虽然对肿瘤细胞有很强的杀伤能力，对肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和B细胞的杀伤能力却很弱。本发明在转染跨膜IL-21和CD137K562细胞的基础上，转染了CD14、CD19和CD86。K562细胞上转染的CD14有助于激活NK细胞识别并杀伤肿瘤相关巨噬细胞；转染CD19有助于激活NK细胞识别并杀伤B细胞；转染CD86有助于提升NK细胞对肿瘤细胞、微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和微环境中的B细胞的杀伤作用。

本发明提供体外扩增和激活NK的方法比用仅转染跨膜IL-21和CD137的K562细胞激活扩增NK细胞的方法，扩增的效率高2.4倍，扩增后的NK细胞对肿瘤相关巨噬细胞的杀伤能力提高了2.7倍。动物实验结果表明：与用仅转染跨膜IL-21和CD137的K562细胞激活扩增的NK细胞相比，采用本发明扩增的NK细胞显著提高了对小鼠体内肿瘤的杀伤能力。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提出一种更具有发展潜力的方法，实现NK细胞的扩增。

本发明是通过下述技术方案得以实现的：

一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)以K562细胞系转录稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD14、CD19、CD86和CD137为膜蛋白，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；

(2)当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，培养K562细胞一段时间，即可以得到在细胞膜上的白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137多肽；

(3)经培养后的K562细胞膜上具有表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的细胞，通过强酸，强碱、和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞；或对K562细胞的依次用硫酸铵或乙醇沉淀，强酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素进行纯化收集；

(4)将上述离心收集的K562细胞与NK细胞、或NK细胞和外周血单核细胞的组合、或是NK细胞与淋巴细胞的组合、或是外周血单核细胞和其它淋巴细胞的组合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137与白细胞的组合进行共同培养、或在纯化分离K562细胞后与PBMC共同培养，激活扩增NK细胞，直至NK细胞代表总数的50％以上。

作为优选，上述方法的步骤(4)中的培养液为：Eagle′s培养液加入10％人血清或10％小牛血清，或RPMI 1640加入10％人血清或10％小牛血清，或F-10(Ham′s)Nutrient mixtures加入10％人血清或10％小牛血清。

作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的剂量在50pM～1nM；为了更好实现本发明，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的剂量在500pM～800pM。

作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137是经过纯化处理的蛋白质，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％。