[发明专利]一种氧化型辅酶II的酶催化制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化型辅酶II的酶催化制备方法。

背景技术

氧化型辅酶II(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，简称：NADP+)是一种极为重要的核苷酸类辅酶，它是氧化型辅酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide, 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸, 简称：NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，是生物氧化过程中不可缺少的氢传递体，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成。这些反应中需要NADPH作为还原剂、氢负供体，NADPH是NADP+的还原形式。NADP+是NAD+通过NAD激酶催化磷酸化所产生。NAD+和DPNA+是各种不需氧脱氢酶的辅酶，可以接受底物分子上提供的氢负离子(H^-)而还原为NADH和PNADH。植物叶绿体中，光合作用光反应电子链的最后一步以NADP+为原料，经铁氧还蛋白-NADP+还原酶的催化而产生NADPH。产生的NADPH接下来在)中被用于二氧化碳的同化。对于动物来说，磷酸戊糖途径的氧化相是细胞中NADPH的主要来源，由它可以产生60％的所需NADPH。

目前人类合成NADP+的方法可以分为化学法和生物法。化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出NADP+，化学法存在反应路线长，反应条件苛刻，选择性差，易生成副产物，产物纯度低，收率低，需用到昂贵的试剂，成本较高等不足；此外，大量有机溶剂的使用还会造成环境污染。因此，该工艺路线不适合于工业化大生产[James Dowden et al, Chemical Synthesis of the Second Messenger Nicotinic Acid Adenine Dinucleotide Phosphate by Total Synthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, [Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4637–4640]。

  传统的生物法是采用发酵或其它微生物培养技术, 并通过对酵母或其它微生物的分离提取得到NADP+。该工艺过程虽然已很成熟，但是原料耗费巨大，劳动强度大，能源消耗大，产量有限，生产成本高，产品价格高，限制了氧化型辅酶II (NADP+)的广泛应用[Sakai, T., Biotech. Bioeng. 1980, 22, Suppl. 1, 143-162; Uchida，T. et al, Agric. Biol. Chem. 1971, 37, 1049-1056; Sakai, T. and Uchida，T. et al, Agric. Biol. Chem. 1973, 37, 1041-1048]。

酶催化转化是一种高选择性反应, 不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类的特定底物, 从而达到定向转化的目的, 酶法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点，被广泛地研究和应用。生物酶法合成NADP+的研究中，Whitesides和其同事构建了聚丙烯酰胺凝胶固定化的NAD焦磷酸化酶和NAD激酶及ATP再生酶催化反应体系, 催化烟酰胺核苷磷酸(简称NMN)合成NADP+的方法[An Efficient Chemical and Enzymatic Synthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) . J. Am. Chem. SOC., 1984, 106, 234-239]。然而，该工艺难于放大，原因在于：一是原料合成烟酰胺核苷磷酸合成收率低，且不易放大，原料来源受到限制；二是酶催化合成NAD+和NADP+只能在克级范围得到高的转化率，但反应时间长达16天，产能低；三是由于采用固定化的NAD焦磷酸化酶和NAD激酶，烟酰胺核苷磷酸和NAD+与固定化NAD焦磷酸化酶和NAD激酶之间的传质受到阻碍，影响了固定化NAD焦磷酸化酶和NAD激酶的催化效率，而且该文作者指出该方法未能放大，因此该工艺路线难于适应放大的要求。有必要进一步开发适应于放大生产需要的新工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种易于工业化放大生产的氧化型辅酶II的酶催化制备方法。