[发明专利]一种高产肝素酶Ⅰ的原核表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种高产肝素酶Ⅰ的原核表达载体的构建方法。

背景技术

肝素酶(heparanase，Hpa)是近年来研究较多的一类D-糖苷内切酶，它不仅存在于正常的组织中，如胎盘和淋巴器官，其对胚胎的形成，新血管的生成，神经系统的发育，炎症反应等都发挥着正常的生理功能；同时也存在于多种恶性肿瘤细胞的表面，能够促进细胞的侵袭和转移，诱导肿瘤血管生成，从而降低肿瘤患者的生存率。目前，研究的重点在于如何抑制肿瘤细胞表面表达的肝素酶活性，从而有效治疗肿瘤。肝素酶的用途极其广泛，其在低分子量肝素及肝素寡糖的制备，肝素及肝素类分子的结构测定，控制肿瘤细胞的生长和转移以及清除血液中残存肝素等方面都具有重要作用。自从Payza等在肝素黄杆菌中发现肝素酶以来，人们在许多微生物中都发现了肝素酶的存在，是近期研究的热点。肝素黄杆菌来源的肝素酶可以分为肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三类，其酶基因的克隆表达、蛋白的纯化和性质研究、以及酶蛋白的改造等相关研究已经有所报道，在作用机制和生物学活性等方面也都有了一定的认识。但目前只有肝素黄杆菌和环状芽孢杆菌的肝素酶基因得到了克隆和表达，而商品化的肝素酶都来源于肝素黄杆菌。

    近期研究发现肝素作为长期以来用于治疗和预防血栓的药物对于人体具有一定的副作用，如影响血小板的稳定，从而导致手术后大出血等。而分子量在4000-8000的低分子量肝素(LMWH)则能够在不产生显著副作用的情况下有效地治疗血栓。截至目前为止，低分子量肝素已经逐步取代肝素成为了首选的治疗药物。低分子量肝素的生产可以分为化学降解法和酶解法。酶解法相对于化学降解法而言具有其独特的优点，例如作用条件温和，酶的专一性高，环境相对友好等，是较理想的工业生产肝素酶的方法。但是利用酶解法生产低分子量肝素的缺点在于： (1)一方面肝素酶的来源有限，其野生菌产量很低并且需要价格昂贵的肝素进行诱导表达，从而导致生产成本过高。另一方面也是由于肝素酶的重组表达极易形成无活性的包涵体，并且不容易复性。(2)微生物来源的肝素酶是一种裂解酶，在裂解反应过程所产生的低分子量肝素的非还原末端的不饱和键严重影响肝素酶的药效，必须通过臭氧氧化法去除。我国是肝素原料的出口大国，但一直未能对低分子量肝素生产技术进行系统的研究。目前低分子量肝素主要来自合资企业生产或者由国外进口，因此，利用酶解法生产低分子量肝素的研究应用前景极为广泛。而肝素酶作为低分子量肝素酶法生产的原材料，其高效生产技术的研究则是备受关注的课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产肝素酶Ⅰ的原核表达载体的构建方法。

一种高产肝素酶Ⅰ的原核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)以F1和R1为引物，

F1：5’-TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG -3’

R1：5’-GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3’

利用PCR反应扩增得到如SEQ ID NO.1所示的编码肝素酶Ⅰ的基因序列；

(b) 将上述编码肝素酶Ⅰ的基因序列连接至pET-28a载体上，得重组表达载体pET28a-HpaI；

 (c) 将重组表达载体pET28a-HpaⅠ质粒转入大肠杆菌BL21菌株。

进一步地，，步骤a中，PCR反应体系为： 10×Buffer 5μl， MgCl₂ 3μl， dNTP 1μl， DNA 1μl， Taq酶0.5μl，引物混合物2μl，双蒸水37.5μl；反应参数为： 97℃5min， 97℃50s、55℃50s、72℃1min 共30个循环， 最后在72℃延伸10min。

本发明构建了肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的原核表达载体。通过应用PCR技术合成了肝素酶Ⅰ基因序列，将该基因序列克隆至载体 pET-28a中, 得到重组表达载体pET-28a-HpaⅠ，再通过CaCl₂转化大肠杆菌，根据生长情况快速筛选出肝素酶活性较高的阳性克隆转化子HpaⅠ，该肝素酶目前可以通过大肠杆菌发酵生产，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的构建流程图。