[发明专利]用于检测磺胺类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种能识别磺胺类药物的单克隆抗体和一种用于检测磺胺类药物的酶联免疫分析方法(ELISA)与试剂盒。

背景技术

磺胺类药物是一类化学合成抗菌药，为畜禽抗感染治疗中的重要药物之一。由于不遵守休药期，造成了磺胺类在可食性动物组织中残留，这对人类健康造成严重威胁。研究表明体内残留过多的磺胺药可能引起过敏反应，容易引起耐药菌的产生等。因此，如何控制磺胺类残留仍然是当前亟待解决的问题，有关部门规定了动物源性食品中磺胺类药物的最大残留限量为100μg/kg。

磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物法、仪器法、免疫法。微生物法敏感性差，耗时较长，且易受到其他抗生素的干扰；仪器法灵敏度高，特异性强，已逐渐成为残留分析主流方法，但是主要用于药物的确证，而且仪器昂贵，要求有技术的检测人员，不适用广泛推广；免疫分析法是以抗原抗体结合反应为原理，在简化前处理和分析过程、降低检测成本方面具有特殊意义，特别是酶联免疫测定法的出现和使用，大大提高了残留分析的效率，已经迅速发展成为大量样品的快速筛选方法。

酶联免疫方法是基于对药物有识别能力的抗体。磺胺类药物抗体的制备主要是针对单个的磺胺类药物，通过N4端芳香氨基与载体蛋白连接，暴露出N1端不同的R基团，例如制备磺胺嘧啶、磺胺喹恶啉等药物的抗体。当保留磺胺类药物的共同结构对氨基苯磺酰胺不变，在N1端通过R基团连接载体蛋白，免疫后却没有得到对常用磺胺类药物敏感的抗体。Sheth和Sporns(1991)合成了具有磺胺噻唑衍生物结构的半抗原，得到的多克隆抗体对9种磺胺药物的IC₅₀值低于5mg/L。Assi(1992)又合成了具有偶氮基团的磺胺吡啶衍生物，得到的多克隆抗体对7种磺胺的IC₅₀值低于10mg/L。Muldoon(1999)采用N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白复合物免疫小鼠，得到的单克隆抗体对磺胺硝苯，磺胺吡啶和磺胺噻唑的IC₅₀分别为1.41、22.8、322μg/L。Cliquet(2003)采用了氨苯磺胺直接和蛋白相连，获得的抗体效价较低，只能识别合成的半抗原，对原型药物没有结合。Franek(2006)为了得到族特异性的抗体，合成了几种单环和双环半抗原分子，由双环抗原得到的抗体建立的直接ELISA方法对15种磺胺药物的IC₅₀低于100μg/L。Zhang(2006)使用两种磺胺母核结构的半抗原连接蛋白，得到的多克隆抗体，在直接竞争ELISA方法中，11种磺胺药在100μg/L以下有50％抑制率。Adrian(2009)获得的多克隆抗体，能够在MRL水平以下，同时检测牛奶中10种磺胺类药物。

可见，现有酶联免疫法在磺胺类药物残留检测的应用主要是针对单个磺胺类药物，商品化试剂盒较多，而磺胺类药物种类多，如果能够建立一种同时检测多个磺胺类药物残留的酶联免疫方法，将大大减少工作量，更有应用价值。目前，国内外对磺胺类药物多残留免疫方法的研究大多处于实验室阶段，建立的ELSIA方法大多数基于多克隆抗体，变异性较大，不够稳定，制备的单克隆抗体亲和力较差，对大多数磺胺类药物识别能力不够。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种能识别多种磺胺类药物的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能用于磺胺类药物检测的酶联免疫方法。

本发明的第三个目的是提供适用于磺胺类药物检测的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测磺胺类药物的酶联免疫试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在检测动物组织磺胺类药物残留中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种能识别磺胺类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201148的杂交瘤细胞4E5所分泌的。

上述杂交瘤细胞4E5，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201148。

所用的免疫原是由半抗原磺胺二甲嘧啶(H1)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备的。

进一步，本发明提供了一种适用于磺胺类药物检测的酶联免疫方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤，具体如下：

(1)将半抗原磺胺二甲嘧啶(H1)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原；