[发明专利]环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域    

本发明涉及禽传染性支气管炎病毒检测技术领域，特别涉及环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物，还涉及一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，还涉及所述禽传染性支气管炎病毒的检测方法。

背景技术   

禽传染性支气管炎又称鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB），是由禽传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的急性、高度接触性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。该病的特征是以幼鸡器官罗音、咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状为主；产蛋鸡则通常发生产蛋量和蛋的品质下降，输卵管受到永久性损伤而丧失产蛋能力。发生肾型传染性支气管炎的病鸡还常表现拉淀粉糊样粪便，肾脏苍白、肿大，肾小管和输尿管内有大量白色的尿酸盐沉积。禽传染性支气管炎病毒的血清型众多，交叉保护力低，引起的临床病多样，给养禽业造成巨大的经济损失。

禽传染性支气管炎病毒诊断方法有很多, 主要有免疫琼脂扩散（AGP）试验、酶联免疫吸附(ELISA)试验、免疫印迹（IBT）、聚合酶链式反应(PCR)以及实时荧光定量(real-time PCR)等。但上述方法存在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、对实验仪器及检测人员的技术要求高等不同缺点, 因此不适合在基层实验室应用。 

江苏省家禽科学研究所于2010年1月8日申请了名称为“基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法”，申请号为“201010017295.5”的中国发明专利申请，公开了使用三对特异性引物即内引物、外引物和环引物对鸡传染性支气管炎病毒进行检测的技术，但此申请并未提及检测灵敏度及特异性的问题，因此，我们无从知晓其公开的试剂盒及方法的灵敏度及特异性，因此此专利申请的技术方案其实并没有实践意义。 

发明内容   

为了解决以上现有技术中尚无有实际检测意义的环介导等温检测禽传染性支气管炎病毒的方法的技术，本发明提供了特异性和灵敏度好的环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物。

本发明的另一个目的是提供一种快速、准确检测禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒。本发明还提供了一种禽传染性支气管炎病毒的检测方法。 

本发明是通过以下措施实现的： 

一种环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)禽传染性支气管炎病毒的引物，共包括外侧引物对、内侧引物对和环形引物对三对特异性引物，三对引物对能与禽传染性支气管炎病毒（GeneBank Accession Number AF470626）中5a-5b（见序列表中序列1）基因结合，序列如下：

外侧引物对：

上游引物F3：5’-TTAGATTTAGTTTATAGGTTGG-3’, 见序列表中序列2，

下游引物B3： 5’-CCTTACCGCTTGCCATGA-3’, 见序列表中序列3，

内侧引物对:

上游引物FIP： 

5’-AACACAATCTAATCCTTCTCTCATTTTGTATGAATAATAGTAAAGATAATCC-3’, 见序列表中序列4，

下游引物BIP：

5’-TACTTTCTTAACAAAGCAGGACATTTTCACAAGTTTTCCCTTGGAATA-3’, 见序列表中序列5，

环形引物对:

上游引物LF：5’-CTTTTCTTGCTATTGCTCC-3’, 见序列表中序列6，

下游引物LB： 5’-CAGAGCCTTGTCCCGCGT-3’， 见序列表中序列7，

外侧引物对、内侧引物对、环形引物对的摩尔比为1:8:4。

引物识别的八个区域位于近年所有禽传染性支气管炎病毒5a-5b基因的保守区，所以引物能够识别所有的禽传染性支气管炎病毒5a-5b基因。本发明提供的禽传染性支气管炎病毒检测试剂盒在使用过程中，所述的外侧引物对、内侧引物对和环形引物对作为一个整体使用，使用时应尽量避免引物二聚体的形成。 

一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液，环介导等温扩增反应液中含有上述三对特异性引物。