[发明专利]用于基因扩增法快速检测迟缓爱德华氏菌的引物

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及用于基因扩增法快速检测迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的引物及其应用。

背景技术

E.tarda是革兰氏阴性短杆菌，爱德华氏菌属，由Hoshina在1962年首次报道，是当前水产养殖业中的有着极大危害的病原菌之一。该菌的宿主范围非常广泛，除可以感染多种鱼类外，也有感染两栖类、爬行类和哺乳类(包括人在内)的报道。因此，为了对E.tarda进行及时诊断、监控和防治，建立一种快速、准确、简便的E.tarda检测技术就具有重要意义。

常规细菌鉴定方法包括对病原形态、生理生化水平及蛋白质水平等的鉴定，但由于检测灵敏度不高，测试项目较多和费时费力等缺点，不能满足快速检测的要求。近年来随着分子生物学、生化技术的快速发展，新的E.tarda的检测方法得到了应用。Chen等(1998)、Sakai等(2007)、Lan等(2008)分别建立了基于hemolysin、fimbrial、gyrB基因的polymerase chain reaction(PCR)检测技术，白方方等(2009)建立了E.tarda的间接ELISA检测方法，Castro等(2010)对以上已报道的PCR方法检测E.tarda特异性进行了比较，结果发现针对fimbrial1型基因簇中的etfD基因设计的引物具有较好的特异性，对所检测的53株E.tarda结果均为阳性。以上方法较传统的细菌常规鉴定具有快速、特异等优点，但以上方法在应用中受到诸如制备抗原及抗体、需要PCR仪和凝胶电泳等专用设备的制约，在生产中不能得到普及应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是Notomi等(2000)发明的一种基因等温扩增技术，该技术针对靶基因序列的6个特异部位设计4条引物(F3、B3、FIP和BIP)并利用具有链置换活性的DNA聚合酶在等温条件下实现高效扩增，具有高特异性、高灵敏和快速反应的特点，已成为病原快速检测的重要工具。Nagamine等(2002)进一步发展了基因等温扩增技术，在原来4条引物的基础上，另添加一对也可启动链置换DNA合成的LOOP环引物LF和LB，从而有效提高反应速度。在E.tarda检测领域，Savan等(2004)首次报道了用LAMP技术检测E.tarda的方法，该方法中根据溶血素基因设计了4条引物，对反应温度和时间的优化结果分别为65℃和45min，应用结果表明可有效检测日本鳗鲡等4种水产动物及养殖水体中分离出的5株E.tarda。但目前尚没有利用6条引物，进行基因等温扩增技术检测E.tarda的相关研究报道，国内也没有用该技术检测E.tarda的报道。

发明内容

本发明的目的是提供用于基因扩增法快速检测E.tarda的引物及其应用。首先通过生物信息学手段，针对E.tarda核苷酸序列具有种间保守及科、属间特异的区域作为引物组的设计区间。所述的核苷酸序列为该菌的EsrB基因区间(964658-965302bp)和溶血素激活因子HlyB域蛋白基因HlyB核苷酸上游序列(991096-991785bp)。引物设计中采用GenBank登记号为CP001135.1的核苷酸序列为基础设计出6套引物组，其中三套引物组设计于EsrB核苷酸序列，另三套设计于HlyB核苷酸上游序列。每套引物组包含有6条引物，记为引物1、2、3、4、5和6。

设计于EsrB基因区间的引物记为第一、二和三套：

第一套引物设计如下：

引物1：设计区间为964658-964698bp，引物长度为20±5bp；

引物2：设计区间为964841-964897bp，引物长度为20±5bp；

引物3：该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为40±10bp；序列1的设计区间为964672-964725bp，引物长度为20±5bp；序列2的设计区间为964713-964769bp，引物长度为20±5bp；

引物4：该引物为针对两段序列分别设计的两段引物并用TTTT连接而成，长度为40±10bp；序列1的设计区间为964750-964807bp，引物长度为20±5bp；序列2的设计区间为964814-964867bp，引物长度为20±5bp；

引物5：设计区间为964694-964748bp，引物长度为20±5bp；

引物6：设计区间为964790-964845bp，引物长度为20±5bp。