[发明专利]重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质提取领域，尤其涉及一种重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法。

背景技术

环境中的重金属通过食物链而在生物体内富集并持久存在，并日益威胁生态环境和人类健康。利用微生物处理工业废水中的重金属，具有费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的关注。

白腐真菌对各种异生物质有广谱而独特的降解能力和降解机制，对溶液中重金属离子也有良好的吸附效果。黄孢原毛平革菌是一种研究较广的白腐真菌，其胞外聚合物主要为多糖和蛋白质，特别是蛋白质中的羟基、羧基、氨基等与重金属离子的吸附与结合有重要关联。研究胞外分泌物中的蛋白质种类、功能、分子量和等电点等，来探讨黄孢原毛平革菌对重金属吸附机理具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种步骤简单、可行、有效的对白腐真菌吸附重金属研究具有重要意义的黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种在重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)培养过滤分离：先液态培养黄孢原毛平革菌，再加入镉离子溶液继续培养，过滤得重金属诱导后的胞外分泌液；

(2)三氯乙酸(TCA)沉淀：在所述胞外分泌液中加入TCA溶液，TCA溶液的添加量为所述胞外分泌液体积的1/9～1/10，沉淀过夜，经离心弃上清液，收集沉淀，得到沉淀物；

(3)丙酮洗涤：用丙酮溶液对所述沉淀物洗涤，离心、弃上清，(经冷冻)得到胞外分泌蛋白。

上述的提取方法中，优选地，所述步骤(1)中，液态培养黄孢原毛平革菌至对数生长期中后期，加入镉离子溶液继续培养的时间为2h～4h，所述镉离子溶液的浓度为40μmol～50μmol。

上述的提取方法中，优选地，所述步骤(2)中，离心弃上清液后，再向此上清液中加入三氯乙酸溶液，并再次经沉淀过夜、离心弃上清液后，最后收集全部沉淀，得到所述沉淀物。

上述的提取方法，所述步骤(2)中，加入的TCA溶液的质量-体积百分浓度优选为98％～100％(w/v)。

上述的提取方法，所述步骤(2)中，优选地，沉淀过夜的温度为0℃～4℃，离心时的温度和转速分别为0℃～4℃和10000rpm～12000rpm。

上述的提取方法，所述步骤(3)中，优选地，丙酮溶液的体积分数为80％～100％，丙酮溶液经过低于-20℃预冷处理，并含0.07％～0.08％的β-巯基乙醇。

上述的提取方法，所述步骤(3)中，优选地，用丙酮溶液对沉淀物洗涤两次，每次洗涤的温度低于-20℃，每次洗涤的时间为5h～10h。

与现有技术相比，本发明的优点为：本发明的在重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，简单、有效；采用质量-体积百分浓度为100％的沉淀剂TCA溶液，能大量沉淀出蛋白，减少沉淀实验中所需处理液体体积；该方法提取得到的胞外分泌蛋白，结合荧光差异凝胶电泳技术，可以得到差异蛋白的种类、功能、分子量、等电点等，可找出在此过程中起主要作用的特异性蛋白和基因调控，为研究重金属等逆境诱导下黄孢原毛平革菌分泌蛋白的变化及抵抗机理提供科学依据。

附图说明

图1是本发明实施例的黄孢原毛平革菌对重金属镉的去除率及吸附量随时间的变化图。

图2是本发明实施例的黄孢原毛平革菌在重金属镉诱导前、后分泌蛋白含量的变化图。

图3是本发明实施例的黄孢原毛平革菌在重金属镉诱导前的蛋白质荧光差异凝胶电泳图。

图4是本发明实施例的黄孢原毛平革菌在重金属镉诱导后的蛋白质荧光差异凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例：

一种本发明的重金属诱导下黄孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)培养过滤分离：