[发明专利]一种鉴别冬虫夏草的线粒体基因序列和方法

说明书

技术领域

本发明涉及鉴别冬虫夏草的线粒体基因序列和方法，具体属于一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列及其操作方法。

背景技术

冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.，别名虫草，是较常用的名贵中药材之一。它是由麦角菌科Clavicipitaceae虫草属Cordyceps冬虫夏草菌寄生在高山草甸土中生活的鳞翅目蝙蝠蛾科Hepialidae昆虫蝙蝠蛾幼虫体内，经过营养生长和生殖生长，形成冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核构成的复合体。冬虫夏草味甘性平，具有补虚损、益精气、滋阴润肺、止血化痰、补肾强壮等功效，常用于治疗肾虚、肺气虚以及肾肺两虚引起的多种疾病，也多用做提高免疫力、抗癌、保肝、延寿等方面的保健品。目前全世界已知的虫草种类有380种，其中最有名气的是冬虫夏草。真正的冬虫夏草菌为野生，长于海拔3000-5000米的高原地区。主要分布在西藏的那曲地区、林芝地区、昌都地区，青海的玉树地区、果洛州一带，四川的阿坝州壤塘、甘孜州理塘、巴塘、德格，云南迪庆州德钦、中甸以北一带，甘肃的甘南州玛曲以西等地。野生冬虫夏草对生存环境要求苛刻、分布地区狭窄、自然寄生率低，造成其天然资源十分稀少。加之冬虫夏草药用价值高、效果好，国内外对其需求量很大，因此价格非常昂贵，随之而来的伪劣品也层出不穷，有些伪品根据形色味也很难与真品区分。此外，不同产地冬虫夏草品质的差异也是比较大的。所有的虫草蝠蛾都是狭域分布类型，常常是同一地区，不同山脉就形成不同的种类，有时同一山脉不同坡向或沟谷也会形成不同的种类^[1，2]。其中西藏那曲、昌都虫草和青海玉树虫草的品质是最高的，价格也最贵。因此，以其他产地的冬虫夏草以次充好的现象时有发生。

目前鉴别冬虫夏草真伪的专利主要是依据冬虫夏草菌的核苷酸序列进行引物设计，虽然可以鉴定冬虫夏草的真伪，但是不能区分其究竟是那曲地区出产的最优质的冬虫夏草，还是别的产地冒充那曲出产的劣质的冬虫夏草，因此不能实际鉴别出冬虫夏草的品质如何。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列及其操作方法，该方法是从冬虫夏草寄主昆虫线粒体基因序列着手，以比较冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾与鳞翅目与其它昆虫线粒体基因的差别，寻找高变异区设计冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾的特异引物，通过序列测定得到寄主昆虫的线粒体相应片段序列，并确定核苷酸序列差异小于1-1.5％为同种不同个体之间的变异率，＞6％即为同属不同种之间的变异率，以此标准来鉴定冬虫夏草的真伪和品质。

本发明提供的一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列，是冬虫夏草寄主昆虫当雄蝙蝠蛾幼虫干标本经基因组DNA提取、通用引物设计、PCR扩增、序列测定、数据分析、选定高变异率区、特异引物设计后PCR扩增得到的核苷酸序列。

本发明提供的一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的操作方法，包括如下步骤：

1)取西藏当雄地区采集的当雄蝙蝠蛾幼虫，经专家鉴定，脱水制备为干标本。挑选保存完好，无虫蛀霉变的干标本，将昆虫干标本剪开取出内容物，用75％酒精擦拭干标本体壁内、外侧2-3次以消除外源物质的污染。

2)取一小节蝙蝠蛾幼虫干标本(约3-4mm长)，于TE(10mM Tris-HCL，200mM EDTA，50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡48小时后，取出浸泡回软后的材料采用酚/氯仿法提取蝙蝠蛾总DNA。

3)参考Simon 2006年所发表的线粒体通用引物序列和已发表的鳞翅目其它物种引物进行首轮扩增。未能得到的序列通过在GenBenk中下载相关昆虫部分线粒体基因序列或全线粒体基因组序列进行ClustalX对比寻找相关保守区域，根据引物设计的基本原则，使用Primer Primier(Ver.5.0)设计相关引物21对，覆盖了线粒体基因组所有序列。

4)根据21对引物进行PCR扩增及PCR扩增产物的序列测定和拼接，得到完整的当雄蝙蝠蛾的线粒体基因组序列。