[发明专利]一种高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌，特别是一种能高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌及其应用。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG)其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。

尽管微生物MTG已实现了工业化生产，但依靠菌种筛选和过程优化的传统发酵技术获得的产量仍然较为有限，远不能满足市场对MTG日益增长的需求。随着蛋白质表达技术的迅速发展，通过分子生物学的方法构建MTG高产重组菌成为国内外研究者关注的一个热点。为进一步提高产量，日本味之素公司率先开展了MTG重组菌构建的工作。随后，德国Martin-Luther University、台湾食品工业发展研究所、台湾国立中兴大学、中科院微生物研究所、华南理工大学及诺和诺德(中国)制药有限公司等相关研究机构或企业相继报导了重组MTG的制备策略。至此，链霉菌MTG已在大肠杆菌、酵母、链霉菌及谷氨酸棒杆菌等宿主中成功表达。由于MTG以酶源形式分泌到胞外，在胞外经活化蛋白酶活化成有活性MTG，因此在在选择大肠杆菌，酵母为表达宿主，不能够直接得到有活性的蛋白，还需经过处理。由于MTG基因来源于链霉菌，且可以被链霉菌的胞外蛋白酶活化，因此链霉菌可以作为MTG表达的理想宿主。

发明内容

为解决MTG产量低，成本高的问题，且基因工程菌无法分泌表达成熟酶的缺陷，本发明提供一种能高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌，可以实现MTG的高效分泌。在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062)，通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genebank：EU477523)。

本发明将MTG基因连接到表达载体pIJ86(购于The John Innes center)，以S.lividan TK24为表达宿主(Hopwood，D.，Bibb，M.，Chate，r.K.，Bruton，C.，1985.Geneticmanipulation of Streptomyces.A laboratory manual.The John Innes Foundations，Norwich，England.)，构建了高产MTG的工程菌。

本发明所用到的培养基：

YEME培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、麦芽提取物3g/L、酵母粉3g/L、蔗糖340g/L、MgCl₂·6H₂O 5mmoL/L、甘氨酸5g/L；

MS培养基：甘露醇20g/L、黄豆粉20g/L、琼脂粉20g/L，pH7.2-7.3；

R5培养基：蔗糖103g/L、K₂SO₄ 0.25g/L、MgCl₂·6H₂O 10.12g/L、葡萄糖10g/L、Difco酪蛋白氨基酸0.1g/L、Oxoid酵母提取物5g/L、TES 5.73g/L。称取5.5g Difco琼脂放入500mL三角瓶中，倒入250mL上述溶液，115℃灭菌15min。使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH₂PO₄(0.5％)2.5mL、CaCl₂·2H₂O(5mol/l)lmL、L-脯氨酸(20％)3.75mL、NaOH(1mol/L)2.5mL；

斜面培养基(g/L)：葡萄糖4g/L、麦芽粉(Difco)3g/L、酵母粉4g/L、琼脂粉20g/L，pH 7.0；

S.hygroscopicus种子培养基(SM)：酵母粉5g/L、甘油30g/L、蛋白胨20g/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L、K₂HPO₄ 2g/L、KH₂PO₄ 2g/L；pH 7.0；