[发明专利]一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法和试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以对人类Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)进行大规模筛查。

技术背景

Duffy抗原(CD234)是一种位于红细胞表面的蛋白，根据首次发现时的患者(Duffy)而命名。该抗原是一种糖基化的膜蛋白及部分趋化因子的非特异性受体，由Duffy抗原趋化因子受体基因编码，该基因亦称为CC家族结合蛋白1、糖蛋白D、FY等。1950年在一名多次输血的血友病患者血清中首次发现了Duffy血型，其血清中含有抗Fy(a)的抗体，次年在一多次生产的妇女血清内发现了抗Fy(b)抗体。运用这两种抗体确定了4种表型：Fy(a+b+)、Fy(a+b-)、Fy(a-b+)及Fy(a-b-)。其中Fy(a-b-)被国际输血协会定义为稀有血型。Duffy血型抗原具有重要的生物学功能：Duffy是间日疟原虫、杂性趋化因子的受体，同时参与了多种疾病的发生与发展过程，如新生儿溶血病、HIV感染、炎症、肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥反应等。

Duffy抗原基因位于人类染色体1.q22-1.q23，为含有两个外显子的单拷贝基因，根据其mRNA的简并与否，Duffy抗原肽可分为主要(336aa)和次要(338aa)两种形式，二者区别在于N-末端的氨基酸残基数目前者为6个后者为8个，但此两种形式均能很好结合抗Fy抗体和趋化因子。Duffy抗原具有7次跨膜结构域，含一胞外N-末端结构域和一胞内C-末端结构域。Fy(a)cDNA 131位碱基为鸟嘌呤(G)，Fy(b)为腺嘌呤(A)，造成Fy(a)和Fy(b)抗原在氨基酸序列上有1个氨基酸残基的区别，前者42位上为甘氨酸(Gly)，后者为天冬氨酸(Asp)。

产生Duffy阴性表型Fy(a-b-)的原因主要有两种，较为常见的是由于Fy基因上游GATA-1结合位点突变引起，GATA-1是一种调节红系细胞基因表达的转录因子，此突变阻止Fy基因转录，Fy糖蛋白无法表达于红系细胞，但其余非红系细胞的表达不受影响，因此体内不产生抗Fy(b)或抗Fy-3抗体；产生Fy(a-b-)的另一原因是点突变导致编码序列中提前出现终止密码，并且截短的Duffy蛋白无法被运送至细胞表面，此类突变个体内所有组织中Duffy抗原表达缺失，因而可伴有抗Fy-3强抗体。

红细胞上Duffy抗原在不同种族间的表达存在高度差异，黑人以Fy(a-b-)表型为主：78％非裔美国人，47-90％非洲黑人为此表型；白人Fya与Fyb等位基因的频率分别为0.425和0.557；中国人群以Fy(a+b+)、Fy(a+b-)为主。临床输血中Duffy血型的鉴定逐渐引起人们的重视。Fya和Fyb抗原具有一定的免疫原性，相应的抗体可引起即发型或迟发型溶血性输血反应，必须输注Fya/Fyb阴性血，因此Duffy血型的鉴定对确保输血安全具有重要的临床意义和实用价值，同时对Duffy抗原的研究促进了对人类多种疾病本质与机理的认识。

我国卫生部于2008年启动了国家稀有红细胞血型库建设项目，其中包括Duffy稀有血型[Fy(a-b-)和Fy(a-b+)]的筛选与鉴定。该项目的实施，将满足临床上对稀有血型血液的迫切需求，减少输血不良反应的发生，提高输血疗效。

目前，Duffy血型抗原的检测主要有血清学和分子生物学方法等。前者主要是应用Fya、Fyb抗血清做间接抗人球蛋白实验，后者主要采用PCR-SSP进行基因分型。上述血清学检测试剂依赖进口，价格昂贵；而常规的基因分型检测过程复杂、操作繁琐、容易产生污染、试剂价格昂贵，不适合大规模的Duffy血型抗原的筛查与鉴定。因此，有必要建立简便、快速、准确而廉价的筛选方法。

发明内容

本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以检测人类Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)。本发明所涉及的方法具特点成本相对低廉，能实现多重反应，产物分析在计算机上完成而避免了人为偏差、并能最大限度地避免常规PCR产物污染，每一反应孔均设内参照、便于对实验质量的监控等特点，从而实现对红细胞Duffy血型基因型快速、准确的大规模筛查。

本发明采用以下技术方案。

它包括下述步骤：

(1)设计扩增引物，用于扩增内参照基因β-actin、Duffy血型Fy(a)以及Fy(b)基因；

(2)制备人基因组DNA；

(3)常规PCR，对扩增引物的有效性和特异性进行初步确认；