[发明专利]欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及林业和植物检疫技术领域，具体涉及一种欧洲型舞毒蛾的检测方法；尤其涉及一种欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测欧洲型舞毒蛾的引物和探针。

背景技术

舞毒蛾Lymantria dispar(Linnaeus)属鳞翅目(Lepidoptera)、毒蛾科(Lyman triidae)、毒蛾属(Lymantria)，是世界公认的全北温带地区森林和观赏性林木害虫。舞毒蛾幼虫寄主范围广，主要有杨、柳、榆、栎、落叶松、椴、云杉等树木。主要分布在欧洲、北美、中国、日本、朝鲜，根据其形态特征、生物学习性和地理分布，舞毒蛾被分为亚洲亚种(L.disparasiatica Vnukovsk ii)、欧洲亚种(L.dispardispar(Linnaeus))和日本亚种(L.disparjaponica(Motschulsky))。亚洲亚种和日本亚种被统称为亚洲型舞毒蛾，其中亚洲亚种在我国有分布，欧洲亚种则被称为欧洲型舞毒蛾。亚洲型舞毒蛾主要分布在亚洲和部分欧洲地区，雌成虫飞行能力强，可为害约500种寄主植物。欧洲型舞毒蛾原产欧洲，于1869年由欧洲传入美国，雌成虫不能飞行，为害约250种寄主植物。

欧洲型舞毒蛾在欧洲为害严重，分布广泛，1948年Cointat就描述了舞毒蛾在法国普罗旺斯地区的大爆发，1962年Kailidis报道了舞毒蛾在希腊的危害，1972年Keremidchiev报道了舞毒蛾在保加利亚的危害等。舞毒蛾在亚洲和欧洲的危害历史久远，近年普遍受到关注的原因是欧洲型和亚洲型舞毒蛾先后被引入了北美，美加持续关注。舞毒蛾最先被引入北美是由一次人为意外。在1869年由E.Leopold Trouvelot将舞毒蛾做为产丝昆虫从欧洲引入美国的波士顿附近，由于在实验室饲养时部分成虫逃逸，10年后舞毒蛾在Trouvelot家的周围大爆发。1890年美国政府和州政府开始了采取喷药进行根除舞毒蛾的行动，但是，由于无法根除彻底而导致行动失败。从那以后，舞毒蛾以每年6～9km的速度向美国的西南方向蔓延。现在，欧洲型舞毒蛾在北美的分布包括了美国的东北方以及东南和中西部的部分地区，受危害的林木面积达200万hm2，还有加拿大东部的部分地区。由于舞毒蛾的检疫重要性，因此，寻求快速、准确的欧洲型舞毒蛾的检测鉴定方法是现阶段检疫技术亟待解决的问题和发展的方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用欧洲型舞毒蛾检测引物及探针可以快速、准确地对欧洲型舞毒蛾进行检测鉴定。

本发明根据亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾这几个地理种群的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物和探针，建立了欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定欧洲型舞毒蛾的目的。

在本发明的一方面，提供一种欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)设计引物和探针；

该引物的序列为：

上游引物EU-F：5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物EU-R：5’-ACAGCTTTCCTTCTACTTTTATCTTTACCT-3’(SEQ ID NO.2)；

该探针的序列为：

欧洲型舞毒蛾探针EU-MGB：FTGGATCTCCTCCTCCTP(SEQ ID NO.3)或其互补链；

(2)提取欧洲型舞毒蛾DNA；

(3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

步骤(2)具体为：取欧洲型舞毒蛾单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括2×Premix Ex Taq 12.5μL，50×ROX Reference Dye0.5μL，步骤(1)设计的上下游引物EU-F/R各1.0μL，EU-MGB探针1.0μL，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃30sec；然后95℃5sec，65℃34sec循环40次。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测欧洲型舞毒蛾的引物，其序列为：