[发明专利]薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒的诊断试剂盒及检测方法，具体是针对薇甘菊萎蔫病毒(Mikania micrantha wilt virus，MMWV)的基因诊断试剂盒及检测方法。

背景技术

薇甘菊(Mikania micrantha H.B.K.)是菊科(Compositae)假泽兰属(MikaniaWilld)多年生藤本植物。目前已生物入侵到我国华南地区，对生态环境造成严重的危害。薇甘菊萎蔫病毒属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)蚕豆病毒属(Fabavirus)。薇甘菊感染该病毒后出现叶片萎蔫、顶枯、节间矮化等症状，可以严重地抑制薇甘菊的生长。该病毒与蚕豆萎蔫病毒-1(Broad bean wilt virus-1，BBWV-1)和蚕豆萎蔫病毒-2(Broad bean wilt virus-2，BBWV-2)有较高的遗传同源性，可以感染蔬菜作物、豆科作物等多种重要的经济作物，造成严重地经济损失。目前对于薇甘菊萎蔫病毒尚无有效的检测方法。

因此简便快速、特异性强、灵敏度高的诊断试剂盒及其方法是早期快速诊断薇甘菊萎蔫病毒及有效监控该病毒传播途径的有效方法。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是利用DNA片段两侧的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。该方法具有快速、灵敏和特异性强等特点，被广泛应用到各项科研工作和生产实践中。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述试剂盒检测薇甘菊萎蔫病毒基因的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒，包含两对特异性引物，分别是：

MMWV RNA1 F：5’-TGAGGAATTGGGAAGGTC；

MMWV RNA1 R：5’-CGACTCGGCGTCATAAAC；

MMWV RNA2 F：5’-GGAATCCCTGAAACTATGC；

MMWV RNA2 R：5’-TGCTCCACCAATCACAACA；

上述两对引物是以MMWV RNA1和MMWV RNA2的保守区域设计的，可以特异性地扩增携带MMWV病毒的待测样品的相关基因片段；

所述的薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒还包括dNTP混合物、含mg²⁺的10倍反应缓冲液和聚合酶；

所述的聚合酶优选TaqE。

一种应用上述试剂盒检测薇甘菊萎蔫病毒的方法，包括以下步骤：

(1)按照常规通用方法提取待测植物样品的RNA；

(2)往步骤(1)得到的RNA中分别加入引物MMWV RNA1 F和MMWVRNA1 R、引物MMWV RNA2 F和MMWV RNA2 R，PCR扩增后分别得到MMWV RNA1 cDNA和MMWV RNA2 cDNA；

(3)往MMWV RNA1 cDNA中加入引物MMWV RNA1 F币MMWV RNA1R，进行PCR扩增得到扩增产物1；往MMWV RNA2 cDNA中加入引物MMWVRNA2 F和MMWV RNA2 R，进行PCR扩增得到扩增产物2；将两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物1在329bp出现明亮的条带，同时扩增产物2在364bp出现明亮的条带，则MMWV为阳性，说明待测植物样品中携带薇甘菊萎蔫病毒；否则MMWV为阴性，表明待测植物样品没有携带薇甘菊萎蔫病毒。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的薇甘菊萎蔫病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以MMWVRNA1和MMWV RNA2的基因保守区域设计的两对特异性引物为主体而设计的。利用两对引物，可以特异性地扩增携带MMWV病毒的待测样品的相关基因片段，所建立的PCR反应体系保证检测结果的快速性、稳定性和准确性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏地检测感染MMWV的样品，可以用于该病毒的跟踪检测，潜在寄主植物的检测，避免病毒的传播流行，加强对薇甘菊生物入侵的生态管理，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是PCR扩增产物电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

薇甘菊萎蔫病毒的基因诊断试剂盒，包括以下组分：