[发明专利]一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因领域，涉及一种用于制备转基因小鼠的精子处理方法。

背景技术

转基因方法已被广泛地应用于现代生命科学研究和基因功能研究的各领域中。目前，基因转移技术主要有DNA显微注射法、ES细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子载体法等。虽然利用这些方法能将外源基因导入靶细胞内，并获得相应的转基因动物，但也存在某些局限性。其中，最常用的DNA显微注射法需要昂贵的实验设备，工作繁琐，技术要求高，外源基因导入率低，生产成本高；虽然逆转录病毒载体法的基因转移效率较高，但基因插入是随机的，且携带的DNA片段大小受限制，产生的后代多为嵌合体；ES细胞介导法虽能在细胞水平进行性别筛选和进行同源同组，但目前仅能在小鼠、仓鼠和人早期胚胎中分离到ES细胞，且建立ES细胞培养技术的条件技术高、成本大，使得该技术的广泛应用受到一定限制。精子载体法(Sperm -mediated gene transfer，SMGT)是最近发展起来的一种转基因技术，因其操作简单、成本低廉、易于筛选，备受研究人员的关注。

早在1971年，Brackett等将家兔精子与H3标记的SV40DNA共培养后，发现精子头部有放射性物质存在，用处理的精子进行人工授精，在2细胞胚胎中能检测到SV40DNA。Lavitrano等用小鼠附睾精子与外源DNA载体共温育，通过卵子体外受精获得转基因鼠，后代中的30％是转基因小鼠，外源基因稳定整合到生殖细胞中，并获得了转基因株系。近几年，国内外许多实验室在多种动物精子介导的转基因实验中获得成功，使得这一技术在较短的时间里得到较快发展。精子介导的基因转移技术因其操作简便、经济、易于推广等优点，在医学、药物学、畜牧业等领域中显示出了诱人的应用前景和开发价值。最近几年，有许多研究人员借助该项技术建立了各种具有特定目的和用途的转基因动物。人们虽然对外源DNA如何整合到受精卵的过程仍有诸多不清楚，但许多实验结果表明精子具有潜在的结合外源DNA并在受精过程中将其转入到卵内的能力。因此，如果精子为载体介导的基因转移技术能够发展到完善的程度，理论上就可以运用到所有由精卵结合产生下一代的动物。研究认为，精子转染外源DNA的过程包括质膜结合和内化转运两个密切相关而又相互独立的基本过程。在各种动物研究发现，结合是一个快速发生的过程，大约在45min内基本完成。结合的外源DNA首先在精子膜表面，随后被内化转运到精细胞内或/和核内，内化转运相对滞后，需要60min左右达到饱和[5]。精子内化对于精子介导转基因非常关键，因为只有内化的外源DNA才有机会进入卵母细胞，也才可能得到转基因动物。

目前应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现：体外精子转染法和体内精子转染法。体内精子转染法又可以分为睾丸内注射法、输精管注射法、曲细精管注射法。体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法、体外电穿孔导入法、二甲基亚砜(DMSO)处理法和脂质体介导转染法等。

外源DNA与精子共孵育，将已获能的精子与外源DNA直接混合孵育，部分精子能吸附外源DNA并且吸附DNA后的精子仍然保持较好的活力，通过体外受精或人工授精及胚胎移植等方法，可以得到转基因动物。DNA与猪精子结合牢固，每个精子可结合3.8×10²个DNA分子，且运动精子比不活动的精子捕捉DNA的效率高，但用此法制备转基因小鼠成功率很低。

脂质体介导法外源DNA，阳离子脂质体是广泛应用的转移DNA的有效手段之一，脂质体自发地与DNA相互作用形成脂质体-DNA复合体。这种复合体较易与精子细胞质膜融合，从而进入细胞内部，同时脂质体的包裹还可以防止核酸酶的降解以及防止DNA被稀释。Rottmann等将DNA用脂质体包裹后，与精子共处理，人工受精的后代中63％为转基因兔。该方法不仅提高DNA转运效率，而且可保护核酶对DNA的降解，已在鸡、兔、小鼠上获得转基因后代，但外源DNA多以附加体形式存在，传代尚有困难。