[发明专利]结核分枝杆菌Wag31基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌基因Wag31及其应用。

背景技术

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是人类健康的严重威胁。近年来，中国结核分枝杆菌感染形式不容乐观，有愈演愈烈的趋势。结核分枝杆菌感染人体后，可侵入巨噬细胞并长期存活，引起肺部肉芽肿的形成，并与巨噬细胞为主的免疫细胞存在复杂的细菌-宿主相互作用。解析它们之间相互作用机理，对于理解结核分枝杆菌感染机制，提出新的控制结核分枝杆菌感染的方法意义重大。

Wag31，是DivIVA同源蛋白，在结核分枝杆菌中保守存在。近期研究表明，wag31广泛参与到结核分枝杆菌的极点生长与细胞壁合成，对菌体生长分裂和菌体形态的维持有重要影响。我们在实验中发现，wag31可以结合淋巴细胞趋化因子XCL2。XCL2由巨噬细胞产生，可以趋化影响树突状细胞、T细胞等多种免疫细胞。进一步的研究表明，Wag31可以诱导XCL2在巨噬细胞中的表达，这提示我们wag31可能在细菌-宿主相互作用、肺部肉芽肿的形成起到关键作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组表达结核分枝杆菌Wag31的方法，得到含有wag31蛋白序列的重组蛋白Wag31。本发明还提供相应的重组质粒。 

本发明提供一种重组蛋白Wag31，该重组蛋白是将结核分枝杆菌wag31的基因片段插入pET30a质粒中，构建表达结核分枝杆菌Wag31的重组工程菌，转化大肠杆菌表达株BL21（DE3）中，表达出的含有wag31蛋白序列的重组蛋白。具体步骤为：以标准毒株H37Rv的基因组作为模板，用PCR法扩增Wag31的基因片段，并将该基因重组到表达型质粒pET30a中，该重组质粒转化至大肠杆菌表达株BL21（DE3）中表达蛋白Wag31。本发明提供的重组蛋白Wag31与NCBI中NP_216661.1蛋白序列相比，加入了表达标签His tag和表达载体上的一小段序列。表达的Wag31蛋白携带6X his-tag，分子质量29.7kd，用亲和纯化法得到的蛋白Wag31蛋白纯度好，得率高，可为进一步的生物学研究创造条件。

本发明所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配，可使用原核细胞或者真核细胞等，例如常用的大肠杆菌（Escherichia coli）。可用于转化的宿主细胞可以是BL21（DE3）菌株，本发明的一个实施例中用的是BL21（DE3）菌株。

本发明还提供一种重组质粒，该重组质粒是含有原核生物的启动子序列和结核分枝杆菌wag31的基因片段。具体是将Wag31基因序列插入一般的商用表达质粒中。Wag31基因的NCBI登录号为NC_000962.2，蛋白的NCBI登录号为NP_216661.1。

本发明所述的“Wag31基因序列”也包括对NC_000962.2中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NC_000962.2核苷酸序列同源性低至约70%的兼并序列也能编码出相同的氨基酸序列，该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与NC_000962.2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NC_000962.2的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。

本发明的重组质粒，通常将Wag31基因插入表达质粒的多克隆位点即得。重组质粒制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作的连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。本发明所采用的载体有pET32a，pET28a，pET30a等。在本发明的一个实施例中，所用的质粒是pET30a。

本发明还提供在真核细胞中表达结核分枝杆菌Wag31蛋白的方法，具体步骤是以标准毒株H37Rv的基因组作为模板，用PCR法扩增Wag31的基因片段，并将该基因重组到真核表达质粒pcDNA3.1/HisA中，该重组质粒转染至THP-1细胞中表达蛋白Wag31。表达的Wag31蛋白携带6X his-tag。可使用His抗体，western blot法检验细胞中Wag31蛋白表达水平。