[发明专利]一种利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定方法，具体的说是一种利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法。 

背景技术

小麦锈病俗称“黄疸病”，是一类由锈菌引致的真菌病害。受害小麦在生长发育期主要表现在叶子或秆上，出现鲜黄色或红褐色的粉泡状病斑。显微镜下观察时，可见病斑中为很多单细胞的夏孢子，称夏孢子堆。它们是由侵入到小麦植株内的菌丝体产生的。小麦锈病在整个生活史中，除了产生夏孢子外，还产生其他类型的孢子，最多的可产生5种孢子，但仍以夏孢子危害严重。夏孢子侵害和蔓延得很快，从侵入新植株到产生出新的夏孢子只需8～12天，造成小麦的严重减产。小麦锈病中度流行年份感病品种减产10～20%，大流行年份一般减产30%左右，特大流行年份减产高达50～60%，严重田块甚至绝收。 

小麦锈病是气传病害，必须采取以种植抗病品种为主，药剂防治和栽培措施为辅的综合防治策略，才能有效地控制其为害。目前，主要以前两种方法为主。这两种防治方法均建立在对小麦锈病的种类已知的前提下，两种锈病的防治策略不尽相同，如在对抗性品种的选择上，抗条锈的品种不一定抗叶锈，反之亦然；在田间管理上与用药品种上两者也不一样。若对小麦锈病的种类未知而盲目的采取方法进行防治，轻则事倍功半，重则加重病害。因此，加强对小麦锈病种类的识别是十分必要的。 

传统的小麦锈菌的鉴别方法是通过形态学观察发病部位和发病症状，然后通过显微镜进行孢子的观察。传统的鉴定方法在小麦锈菌的识别上有一定的普遍性，但由于小麦锈菌的外部病症易受外界环境因素的影响，加上在小麦苗期叶锈与小麦苗期条锈初发期的症状区别不大，十分容易混淆。在基层较难通过传统的鉴定方法进行准确鉴定，这就给当地的防治带来了困难。 

真菌的孢子壁相对要比真菌的菌丝的细胞壁厚，在孢子量很少的情况下很难通过直接研磨的方法破坏孢子的细胞结构，这就使得常规的DNA提取方法无法应用到单孢子堆DNA的提取。目前孢子DNA的提取方法主要是通过机械物理破壁或化学溶解破壁。机械物理破壁往往需要一定的设备和技术条件才能达到破壁的目的，如超声波破碎仪等，这在当前我国基层植保机构尚无法全面配置。而化学溶解破壁则需要在前期加入化学物质溶解孢子壁，所加的物质多为乙酸乙脂等，破壁结束后需要对其中的DNA进行回收纯化，去除可能影响下一步PCR反应的化学物质，且去除的完成度将会大大影响下一步的成功率。 

发明内容

本发明针对上述问题的不足，提供一种利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法，其鉴定方法操作简单，鉴定结果迅速准确，可以应用到实际生产中。 

本发明涉及的试剂：DNA凝胶回收试剂盒购买于碧云天生物技术研究所，该试剂盒中自配有成品的DNA纯化结合液，洗涤液，洗脱液，DNA纯化柱，收集管； 

本发明为解决上述问题所采用的技术方案是：一种利用巢氏PCR鉴定小麦叶锈病单孢子堆的方法，其方法步骤为：

步骤一、单孢子堆DNA模板的制备

1）单孢子堆获取：取干净、无菌的培养皿，在培养皿的皿底垫三层滤纸，加入无菌去离子水，使滤纸湿润，将含有滤纸的培养皿放置在紫外灯下，消毒20分钟，备用；

2）用20μL的移液枪吸取5μL无菌去离子水，将去离子水打出在移液枪的枪头顶端形成一个水球，然后用水球在染病的小麦叶片上蘸取一个单孢子堆，将含有单孢子堆的无菌去离子水注入无菌的0.5mL PCR管Ⅰ中，将0.5mL PCR管Ⅰ开口放入步骤1）中的培养皿中，备用；

3）含有单孢子堆的0.5mLPCR管Ⅰ置于25℃条件下，培养24小时，使孢子萌发，后取出含有孢子的0.5mL PCR管Ⅰ，将其置于-20℃条件下，放置24小时，取出，在含有孢子的0.5mL PCR管Ⅰ内加入10μL的灭菌细石英砂，研磨均匀，得到匀浆液，备用；

步骤二、引物的设计及合成

设计并合成外引物ITS1-F、外引物ITS4-B及内引物ITS1、内引物ITS4，其外引物及内引物的序列如下：

ITS1-F：5'-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3'

ITS4-B：5'-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3'

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

步骤三、利用外引物进行第一次PCR扩增