[发明专利]一种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和分析技术领域，具体的说是一种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统及其在木糖快速检测中的应用。

背景技术

木糖是一种重要的碳水化合物，在人们的生产生活中具有非常重要的作用。在自然界中，天然D-木糖是以多糖的形态存在于植物中，它们在农产品的废弃部分中(例如玉米的穗轴、秸秆、棉桃的外皮)含量很高，木糖是其自然降解和人为降解中的重要产物。利用木糖发酵生产乙醇可以提高原料的利用率和燃料乙醇的产量，降低燃料乙醇的生产成本，因此目前已经受到越来越多的关注。在细菌中有的能利用D-木糖作为碳源生长，在动物中羊几乎能完全地利用木糖。在动物的蛋白多糖中D-木糖与多肽链的丝氨酸残基以糖苷键连接，成为多糖侧链与蛋白质的桥接结构。木糖醇是木糖通过加氢制得的，其用途非常广泛。在发达国家木糖已应用于宠物饲料。木糖可以作为糖尿病人的耐受性好的无热量甜味剂、营养剂和治疗剂。它还可以作为加热食品增香剂，用于焙烤食品、火腿、香肠、腊肉、人造肉等。木糖还被广泛应用于肉食加工、肉类香料以及制备食品抗氧剂等方面。另外，木糖已作为软化剂、离子表面活性剂、增塑剂、水分调节剂等用于油漆、牙膏、卷烟、制革、铸造、火药等多种行业。因此，快速、高灵敏度、高选择性、实时的木糖检测对遗传、人类营养、食品技术、医药以及包括生物燃料在内的生物过程等领域极其重要。

目前，木糖的检测方法有还原法、酶学方法、色谱法、拉曼光谱法和红外光谱法等。但是这些方法存在各种各样的问题，例如，采用还原法检测时，其灵敏度较低，而且易受到其他有颜色和还原性物质的干扰；在酶学方法中，酶的来源和纯化是个至关重要的问题；色谱法包括气相色谱法、液相色谱法和离子色谱法，存在的主要问题是样品制备过程复杂、操作费时、误差较大、需要昂贵设备等。因此，建立一种快速、灵敏、特异的木糖实时检测方法，势在必行。

酶学方法的优点是灵敏度高、特异性好，但是酶的纯化和稳定性是难以解决的问题。木糖脱氢酶(XDH)(EC 1.1.1.175)是一些微生物中木糖代谢途径的关键酶。木糖在木糖脱氢酶的催化下，借助于辅酶NAD⁺，被氧化成木糖酸内酯，辅酶NAD⁺则被还原为NADH。

细菌表面呈现系统是微生物表面呈现系统的一个重要分支，其基本策略也是将外源蛋白或多肽与细菌表面蛋白融合或嵌合并活性表达于细菌表面。自从发现大肠杆菌外膜蛋白LamB、OmpA和PhoE能够作为外源蛋白的表面呈现载体以来，该技术得到了迅猛发展，现已成为研究的热点，在微生物学、分子生物学、疫苗学等多个领域的基础和应用研究中得到了广泛应用。冰核蛋白(ice-nucleation protein，INP))是丁香假单胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成。INP通过糖基磷脂酰肌醇而锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。冰核蛋白细菌包括假单胞菌属、欧文氏菌属和黄单胞菌等。目前，利用全长的冰核蛋白、去掉中间重复序列的串连N端、C端结构域的蛋白或只用N端结构域的蛋白均在大肠杆菌表面成功展示了外源蛋白，例如：绿色荧光蛋白、几丁质酶和磷酸盐结合蛋白等。近年来，在Pseudomonas borealis菌株中发现一种新的冰核蛋白基因inaPb，它与已熟知的冰核蛋白只有～66％的同源性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于冰核蛋白的细菌表面展示系统及其在木糖检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统：细菌表面展示系统为编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N。

编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N融合，表达于宿主细胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统。

基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统的应用：所述细菌表面展示系统用于木糖的高特异性、高灵敏度检测。所述细菌表面展示系统用于D-木糖的高特异性、高灵敏度检测。

检测原理是木糖在菌体表面的木糖脱氢酶的催化下，借助于辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)被氧化成木糖酸内酯，辅酶NAD⁺则被还原为还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH在340nm处有特征吸收峰，因此可以根据340nm处的吸光值来求得木糖的含量。

本发明的效果是：