[发明专利]一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法

说明书

技术领域

本发明涉及罗非鱼种质资源保存和精子低温生物学技术领域，更具体涉及一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，特别是针对尼罗罗非鱼精子进行超低温保存。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)为一种中小形鱼，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。原产于非洲，上世纪70年代被引进到我国，目前已成为我国一个重要的水产养殖品种。随着我国对罗非鱼品种的选育和改良，除最初引进的尼罗罗非鱼(O.niloticus)和奥尼亚罗非鱼(O.aureus)外，又培育了许多新的品种。如：尼罗罗非鱼和奥尼亚罗非鱼的杂交后代奥尼罗非鱼；通过3系杂交选育的后代尼罗超雄鱼；以及由8个品系的尼罗罗非鱼经杂交混合选育的吉富罗非鱼等。

为了能进一步开展罗非鱼的新品种选育，以及罗非鱼的人工繁殖，为市场提供更优质的罗非鱼新品种和苗种，需要进行罗非鱼精子超低温保存。然而，不同鱼类的精子其外形、大小、密度、渗透压、激活后的寿命以及其它生物学特性都不一样。因此，不同鱼类的精子要求有不同的冷冻方法。尼罗罗非鱼精子超低温冷冻保存方法除了有一般鱼类精子冷冻保存所必须的步骤外，还有几个关键步骤。这些关键步骤的参数都是由尼罗罗非鱼精子的生物学特性决定的。

1.精子的渗透压不同决定了精子的稀释液配方就不同。渗透压过高的稀释液会使精子在稀释过程中严重脱水，精子内部渗透压迅速升高，造成精子破裂。渗透压过低的稀释液，又会使精子在冷冻过程中不断被激活，从而导致大量精子死亡。尼罗罗非鱼精子的渗透压在280～285mOsM之间，这就要求尼罗罗非鱼的精子稀释液渗透压也在这个值的区间，从而确保精子在被稀释后，即不被激活也不破裂。

2.不同鱼类的精子密度不同，决定了在冷冻过程中精子的稀释比也不尽相同。尼罗罗非鱼精液中所含精子的密度一般为1.4～1.8×10⁹个/ml。当对罗非鱼精子进行超低温保存时，含高密度精子的精原液是不能直接进行超低温冷冻保存的。这是因为在冷冻过程中，当温度降到0℃～-20℃区间时，被保存的精液中会形成冰晶，冰晶像锋利的刀一样刺向四周的精子，将精子刺破。这种在冷冻过程中冰晶对精子的物理损伤将直接导致精子超低温冷冻保存的失败。因此，冷冻前必须要对精子进行稀释。如果稀释比较低，稀释不够，则精子密度仍然过高，精子被刺破的概率也仍然很高。稀释比过高，则影响了精子保存的总量，精子保存的效率很低，而且还会影响到后期的冻精授精。

3.不同鱼类的精子膜通透性也不尽相同。精子膜的通透性决定了精子冷冻前在稀释液中的最小平衡时间。通透性好的精子平衡时间较短，通透性差的精子平衡时间较长。因此，每一种鱼的精子都有一个相对恒定的最小平衡时间。精子在达到最小平衡时间后可以维持一段时间精子活力不衰减。不同的鱼类这段时间是不完全相同的，它与精子被激活后的寿命有关。一般来讲，当激活液选择正确时，寿命越长，则这段时间也越长。尼罗罗非鱼精子的这段时间在4℃冰箱中可维持1小时40分钟。超过这段时间，精子就开始呈几何级数衰减。

4.由于不同鱼类精子的大小、形状不同，导致温度在精子中的传导速度和时间也不相同。因此，每种鱼精子超低温保存的降温程序也不尽相同。尼罗罗非鱼精子的降温程序是经过反复试验后摸索出来的。

上述因素的综合效应决定了尼罗罗非鱼精子的超低温冷冻保存必须要有其特定的方法。本发明中的方法是根据尼罗罗非鱼精子的生物学特性所设计的，目前已成功的应用到尼罗罗非鱼精子的超低温保存中。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，方法易行，操作简便，应用该方法保存尼罗罗非鱼精子，可最大限度的提高精子复苏后的存活率，减少冷冻过程对精子的各种损伤。对尼罗罗非鱼精子进行超低温保存，从而为罗非鱼的选育种提供必须的材料和手段。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，其步骤是：

(1)尼罗罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，前面几滴(3-6)精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀。

(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存。将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用。