[发明专利]一种手足口病疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种手足口病疫苗及其制备方法，尤其涉及手足口病疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。 

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，其和柯萨奇病毒A16(CA16)是手足口病(HFMD)重症病例的主要病原体，且能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病，致残及病死率很高，备受人们关注。1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚患者中分离到EV71，随后世界上许多国家相继报道了EV71在不同地区的流行情况。近年来，EV71感染引起的手足口病在亚太地区，尤其在我国北京、安徽、河南、山东等地较为严重。 

目前，EV71疫苗的研究已取得一定的进展，正在研发的疫苗包括灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和转基因口服疫苗。虽然各种疫苗均具有一定的免疫原性和免疫效果，但最适疫苗的确认还需要对各种疫苗进行安全性和有效性的评价。Wu等比较了灭活病毒疫苗、VP1 DNA疫苗和重组VP1蛋白亚单位疫苗，虽然灭活病毒疫苗诱导的特异性免疫应答强度高于亚单位疫苗，但灭活疫苗存在安全性问题。因此，有人探究了安全性更高的病毒样颗粒的免疫效果[Wu CN, Lin YC, Fann C, et al. Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus [J]. Vaccine, 2001, 20(5-6): 895-904.]。Chung等研究表明，EV71病毒样颗粒能引起较强的抗EV71免疫应答，有望成为一种新型EV71疫苗[Chung YC, Ho MS, WU JC, et al. Immunization with virus like particles of enterovirus71 elicit potent immune responses and protects mice against lethal challenge [J]. Vaccine, 2008, 26(15): 1855-1862.]。此外，国外有研究将VP1基因转入西红柿制备转基因疫苗，也具有一定的保护效果。 

杆状病毒表面展示系统是近几年发展起来的一种新型的真核展示系统，通过在AcMNPV等Ⅰ型出芽病毒的糖蛋白gp64插入外源蛋白，二者融合表达或与特异性的锚定部位结合，帮助外源蛋白进行蛋白质翻译后正确折叠和糖基化、磷酸化等加工修饰，尤其适合展示需在内质网等细胞内进行特异性翻译后经加工修饰才具有生物活性的高等真核细胞分泌蛋白和表面蛋白。杆状病毒表面展示技术已应用于新型疫苗的研制、基因转导与基因治疗、单克隆抗体的制备和抗原表位的分析等细胞、免疫与分子方面研究的各个领域，并已成为研究热点。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的手足口病疫苗。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将手足口病主要抗原蛋白(肠道病毒71型的主要抗原蛋白)基因EV71 VP1序列展示在家蚕杆状病毒表面，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为手足口病疫苗原进行生产，相比于传统手足口病疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。 

为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 

一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64VP1，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5603。

上述家蚕重组杆状病毒Bmgp64VP1的制备方法，包括以下步骤： 

(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通过BamH I/EcoR I和Xho I/HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBacI-gp64；