[发明专利]一种手足口病疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64VP1，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5603。

2.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64VP1的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通过BamH I /EcoR I和Xho I /HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的杆状病毒表面展示载体pFastBacI-gp64；

(2)由PCR扩增的方法获得手足口病主要抗原蛋白基因EV71 VP1序列，其5’和3’端分别引入EcoR I和Xba I酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBacI-gp64，构建成重组杆状病毒转座载体pFastBacI-gp64-VP1；

(3)取步骤(2)所得的重组杆状病毒转座载体pFastBacI-gp64-VP1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，培养20~24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定；

(4)取步骤(3)所鉴定成功的重组杆状病毒基因组转染家蚕BmN细胞，发病后收集1.5~2ml细胞液，4℃，5000rpm离心10~15min，获得含重组病毒的沉淀，提取病毒基因组用M13引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64VP1。

3.一种权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64VP1表达的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

4.一种权利要求3所述抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求3所述的重组杆状病毒Bmgp64VP1感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

(2)针刺接种法接入家蚕五龄幼虫、蛹；

(3)收集表达的权利3所述抗原蛋白。

5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64VP1在手足口病疫苗制备中的应用。

6.一种权利要求3所述的蛋白在手足口病疫苗制备中的应用。