[发明专利]一种无假阳性转基因小麦的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种无假阳性转基因小麦的生产方法。

背景技术

小麦是重要粮食作物，小麦生产的可持续性对于国民经济的发展和社会的稳定具有重要意义。然而，全球气候异常现象的频繁发生，使小麦生产面临着巨大的挑战。培育抗旱、抗寒、优质、抗病的优异种质资源是突破目前小麦单产徘徊不前的关键，但是常规杂交育种技术只能将小麦种内的优异变异进行聚合，无法实现物种之间的基因交流。转基因技术为利用外源基因进行种质创新提供了良好的技术平台。

目前，小麦的转基因方法主要有花粉管法、基因枪法和农杆菌介导法，其中花粉管法是利用小麦花粉萌发形成的花粉管通道，将外源基因导入受体当中。该项技术不需要愈伤组织的培养过程，因而相比于基因枪法既简单又经济，但因其重复性差，很难获得分子证据，在小麦上的应用越来越少；基因枪法是以金粉或钨粉作为载体，通过高压轰击受体组织将外源基因导入到受体细胞中，并实现基因整合。但基因枪法除了需要消耗昂贵的大载体、可裂膜、阻挡网等一次性耗材外，插入到受体细胞中的基因往往是随机整合，并且多拷贝插入。因为小麦是异源六倍体，基因组非常庞大，多拷贝插入除了影响基因的表达效率外，转基因后代纯合较慢，难以迅速获得纯合株系。另外，筛选标记难以去除也是限制基因枪转化小麦的主要因素之一。农杆菌法则克服了上述两种方法的缺点，其原理是用目标基因替换根癌农杆菌上的致癌基因，在农杆菌侵染受体材料时，目标基因被释放整合进入受体细胞，这种插入往往以单拷贝或低拷贝的形式发生，而且作为质粒复制所需要的筛选标记被留在体外，提高了转基因的安全性。

基因枪和农杆菌转化所用的受体材料多种多样，主要有幼胚、幼穗和成熟胚。其中幼胚以其愈伤组织容易诱导和再生率高等优点，应用最广。但是转化后的受体材料中只有部分细胞被转化，如果不经过筛选就直接再生成苗，就会形成嵌合体，无法获得可以遗传的转基因株系。因此，这些受体材料在经过转化后都需要一个恢复培养、愈伤组织筛选和再生的过程。表达载体上的筛选标记在转化细胞的筛选过程中非常重要。筛选标记基因的主要功能是：这种基因的产物能使转化细胞产生一种选择压力，致使未转化的细胞在施加选择剂条件下不能生长、发育和分化。而转化细胞对该选择剂具有抗性，可以继续存活，因而有利于从大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株。

目前，转基因小麦常用的选择基因有抗生素抗性基因(hptII，nptII)和抗除草剂基因(bar)。hpt基因的表达产物可以抗潮霉素(Hygromycin B)，潮霉素进入非转化细胞，可与细胞内30S核糖体结合，使细胞中蛋白质合成受阻，细胞就逐渐褐化死亡。而hpt基因整合到细胞染色体上时，就可表达出潮霉素磷酸转移酶，将磷酸共价结合到潮霉素上，使进入转化细胞内的潮霉素失活。bar基因的表达产物可以抗L-phosphinothricin(PPT)，PPT是谷氨酸的一种类似物，由于它的存在抑制了细胞内的谷氨酸合成酶活性，使细胞的转氨作用受阻进而引起细胞的氨中毒。bar基因是小麦转化中一个非常有效的选择标记基因并已成功地应用于许多转化研究中。nptII基因的表达产物可以拮抗卡那霉素，但小麦对卡那霉素存在内源的抗性，利用卡那霉素作为筛选剂，其筛选效果不明显。而G418做为卡那霉素的一种类似物用于选择则非常有效，而且用G418选择的愈伤组织再生后的绿苗率更高。

但是，无论是上述哪一种筛选剂，在获得的转基因植株中总是存在很大比例的假阳性植株，为转基因后代的分子鉴定和田间繁育工作带来很大的困扰。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种生产转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将目的DNA导入植物盾片中，培养，得到愈伤组织；

2)切割步骤1)得到的愈伤组织，得到愈伤组织块；

3)将步骤2)得到的愈伤组织块依次进行诱导筛选培养、再生筛选培养、后期筛选培养，得到生根转基因植物，即为目的转基因植物(无假阳性转基因植物)。

在上述方法中，步骤1)中，所述盾片为将植物种子的胚轴和盾片接触处切除胚轴，得到的组织；

步骤1)按照如下方法操作：先用基因枪将所述目的DNA导入植物盾片中，得到轰击后的组织，再将所述轰击后的组织在诱导筛选培养基中进行预诱导筛选培养，得到愈伤组织；

上述诱导筛选培养基按照如下方法制备：将2，4-D、G418和MS培养基混合，得到诱导筛选培养基，所述2，4-D在所述诱导筛选培养基中的浓度为2mg/L，所述G418在所述诱导筛选培养基中的浓度为30mg/L；