[发明专利]一种检测血液样本中过敏原特异性IgE抗体的免疫层析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测血液样本中过敏原特异性IgE抗体的免疫层析方法。

背景技术

免疫层析是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（如抗体或抗原）发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过酶反应或直接运用可目测的标记物（如胶体金）而得到直观的实验现象（如显色）。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。

免疫层析技术目前已广泛应用于临床医疗检测中。国内外现有的商品供应及文献报道的检测项目主要包括以下方面：违禁药物检测（苯丙胺、可卡因、大麻、吗啡、海洛因等）、传染病病原检测（梅毒螺旋体、淋球菌、沙眼衣原体、幽门螺杆菌等）、激素检测、寄生虫、肿瘤标记物、心血管病检测标志物等。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金，乳胶，胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。

由于正常情况下血清IgE抗体仅在ng/ml水平，用常规测定IgG或IgM的凝胶扩散法检测不出IgE，因而目前常采用免疫层析法来进行检测。然而，现有的进行血清IgE抗体检测的免疫层析法将特异性过敏原直接连接到标记物乳胶微球上形成过敏原-乳胶微球复合物，相当于一比一的连接关系，灵敏度低，用于检测ng/ml水平的特异性IgE抗体时，检测结果颜色暗淡，不容易观察。

生物素-亲合素系统（Biotin-Avidin-System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。近年大量研究证实，生物素-亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素-亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的检测血液样本中过敏原特异性IgE抗体的免疫层析方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种检测血液样本中过敏原特异性IgE抗体的免疫层析方法，其首先将样品垫、结合垫、包被有检测线和质控线的层析膜、吸水垫依次相互交错粘贴在底板上，构成免疫层析试纸条，然后向样品垫中滴加血液样本进行检测，其特征在于：所述结合垫上结合有过敏原-生物素-亲合素-乳胶微球，所述方法利用血液样本中的过敏原特异性IgE抗体能够与过敏原-生物素-亲合素-乳胶微球结合形成结合物，以及所形成的结合物能够在检测线处被捕获而呈现色带来实现对过敏原特异性IgE抗体的定性检测。

根据本发明的进一步实施方案：所述的过敏原-生物素-亲合素-乳胶微球通过如下方法制备：首先将过敏原与生物素连接形成过敏原-生物素，将亲合素与乳胶微球连接形成亲合素-乳胶微球，然后再将所形成的过敏原-生物素与所形成的亲合素-乳胶微球连接，即得。

根据本发明的一个具体方面，过敏原-生物素-亲合素-乳胶微球的具体制备过程如下：

①将过敏原溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，将生物素溶于去离子水中，然后将生物素的水溶液滴加至过敏原的磷酸盐缓冲液中，在室温下搅拌，得到含有过敏原-生物素的溶液；

②将亲合素溶液溶于脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液（MES）中，将乳胶微球储存液剧烈震荡，取出微球于离心管中，离心，除去上清，加入脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，剧烈震荡，加入溶有亲合素的脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液和新鲜配制的碳二亚胺溶液（EDC），剧烈震荡，使混合均匀，在室温暗室孵育20～40分钟，加入吐温-20，离心，除去上清，加入十二烷基硫酸钠水溶液（SDS）溶解微球，剧烈震荡，离心，除去上清，加入磷酸盐缓冲液溶解微球，剧烈震荡，得含有亲合素-乳胶微球的溶液；

③将步骤①制得的含有过敏原-生物素的溶液加入步骤②制得的含有亲合素-乳胶微球的溶液中，轻轻搅拌直至微球全部悬浮起来，然后在室温下持续搅拌10～15小时，即得含有过敏原-生物素-亲合素-乳胶微球的溶液。

根据本发明，通过喷涂所述含有过敏原-生物素-亲合素-乳胶微球的溶液使过敏原-生物素-亲合素-乳胶微球结合到结合垫上。