[发明专利]鲍曼复合醋酸钙不动杆菌OXA-23 突变基因的荧光定量PCR 试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及耐药基因的检测试剂盒及方法。具体而言，本发明根据新筛选的OXA-23基因突变的鲍曼复合醋酸钙不动杆菌菌株，设计了检测OXA-23突变的鲍曼复合醋酸钙不动杆菌的荧光定量PCR试剂盒，本发明也涉及其检测方法。 

背景技术

不动杆菌是一类非发酵、严格需氧的革兰阴性杆菌，普遍存在于自然界中。不动杆菌属至少可分为32个基因种型，其中鲍曼不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、不动杆菌基因种型3及13TU通过常规表型鉴定难以区分，合称为鲍曼复合醋酸钙不动杆菌复合体。 

鲍曼不动杆菌为不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。该菌在医院环境中分布很广且可以长期存活，极易造成危重患者的感染，因此常从被感染患者的血、尿、脓液及呼吸道分泌物等标本中分离出，在非发酵菌中感染仅次于假单胞菌。 

鲍曼不动杆菌在医院分布以ICU病区最多，其次为呼吸内科患者。感染的病人多是老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者，以及使用各种侵入性操作和长期使用广谱抗生素治疗的患者。又因为该菌对湿热紫外线及化学消毒剂有较强抵抗力，常规消毒只能抑制其生长而不能杀灭，而抵抗力弱或有创伤的 患者可能被从医务人员的手或消毒不彻底的医疗器械所带有的细菌感染的机会较多。 

近年来，不动杆菌属在临床样本中的分离率逐年提高，而鲍曼不动杆菌约占其中的80％-90％。鲍曼不动杆菌可引起呼吸机相关肺炎、尿路感染、败血症、创口感染及中枢神经系统感染等。由于鲍曼不动杆菌具有极强的环境适应能力和获得外源性耐药基因的能力，因而极易造成医院内的播散流行。鲍曼不动杆菌可以通过质粒、转座子和整合子等可移动基因元件，获得对多种抗菌药物的耐药性。对1株欧洲克隆Ⅰ多药耐药菌株的全基因组序列分析发现，在一段长约86kb的染色体片段上聚集了45个耐药基因，包括VEB-1、AmpC、多种氨基糖苷类抗菌药物修饰酶，形成了被称为AbaR1的耐药基因岛。该耐药基因岛与假单胞菌属、沙门菌属和大肠埃希菌的基因片段具有同源性，证实为获得性外来序列。在另1株欧洲克隆Ⅱ的MDRAB(ACICU)的染色体中亦发耐药基因岛AbaR2。鲍曼不动杆菌整合外源性基因的能力，使其具有对临床所用抗菌药物产生耐药性的巨大潜力。在众多的耐药基因中β-内酰胺酶基因是鲍曼不动杆菌最主要的耐药基因，包括超广谱β-内酰胺酶类(属A类，包括TEM-型、SHV-型、SIM-型、PER-型等基因)、金属酶类(属B类，包括IMP和VIM基因)、OXA型酶(属D类)等。OXA-23型酶，水解青霉素和头孢菌素、碳青霉烯，使菌株产生对亚胺培南类抗生素的耐药性[Livermore DM，Woodford N.Carbapenemases：a problem in waiting.Curr Opin Microbiol，2000，3(5)：489-495.]。 

多药耐药鲍曼复合醋酸钙不动杆菌的出现，给医院感染控制及临床治疗带来了极大的困难，由于感染的病人多是老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者，如不及时选择鲍曼复合醋酸钙不动杆菌敏感的抗生素进行治疗，将会危 及患者的生命安全。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明公开了鲍曼复合醋酸钙不动杆菌OXA-23突变基因的实时荧光定量PCR试剂盒及其方法。 

本发明首先公开了鲍曼复合醋酸钙不动杆菌OXA-23突变基因的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的试剂盒包括特异性引物、特异性探针、标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。本发明的试剂盒可采用以下方法实施： 

根据新筛选出的D类β-内酰胺酶耐药基因OXA-23的突变体的序列，所述突变体核苷酸序列为Sequence NO.3，其所编码的蛋白质氨基酸序列为Sequence NO.7。根据Sequence NO.3设计探针和上、下游引物。所述的上游和下游引物的序列分别见Sequence NO.4和Sequence NO.5，所述的探针序列见Sequence NO.6。 

或者包含有上述序列的向5’端延长的序列； 

或者与上述序列同源性大于85％的序列。