[发明专利]一种基于双酶偶联高通量检测微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的新方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物筛选和开发利用领域，特别涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检查微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的检测方法。 

技术背景

过去的200多年，建立在煤炭、石油、天然气等化石燃料基础的能源体系极大地推动了人类社会的发展。然而近年来，由于石油、天然气、煤炭等能源的过量开采与消耗，世界已面临严重的能源危机，而且国际原油价格攀升不下，对石油需求量日益大增，自1993年我国首次成为石油产品净进口国以来，2010年全年原油进口21，845万吨，所以寻找清洁、廉价、可再生的替代能源成为未来能源战略的关键。燃料乙醇和燃料丁醇被认为是可以代替石油、煤炭等化石燃料 

作为替代高污染化石燃料的理想选择，生物燃料早已受到世界各国重视。近年来，美国、巴西、韩国、印尼等国家以及欧盟都相继出台了支持生物燃料普及的能源发展战略。欧盟计划到2020年用生物燃料替代20％化石燃料。美国的《国家生物燃料行动计划》也提出，2020年生物燃料将占其能源总消费量的25％，2050年达到50％。燃料乙醇、燃料丁醇是由生物资源经过一系列的物理、生物、化学变化过程而获得的可再生燃料，具有热值高、性能好、使用便捷等优点。丙醇、戊醇和己醇均是良好的化工原料，广泛应用于涂料、印刷油墨、日化用品、医药和农药中间体的生产以及合成饲料添加剂和香料等。实现生物燃料生产的核心是获得性能优良的微生物菌种。 

在微生物代谢过程中，乙醇作为产物被释放到培养基中，为了验证微生物的产乙醇能力，需要测定培养基中的乙醇含量。目前乙醇测定的常用方法主要包括比重法、比色法、气相色谱法和液相色谱法。比重法操作简便，可用于高含量乙醇测定，但对乙醇测定特异性，但是微生物代谢过程中，产生的乙醇含量很难达 到比重法检测的最低限；比色法，如重铬酸钾比色法和碘量法，显色缓慢且不稳定，受多种因素干扰，操作较为繁琐；色谱法能检测微量乙醇，精密度和准确性很高，但仪器昂贵、操作和维护繁琐。另外，还有红外光谱、荧光和激光拉曼光谱等乙醇分析方法的报道，但仍处于实验室研究阶段。另外利用醇脱氢酶可以检测乙醇含量，但是醇脱氢酶需要依赖于NDA⁺，但是NDA⁺相当昂贵，且需要在340nm出测定吸光值，因此就需要紫外检测器，增加了检测的费用。因此，寻求简便、快速、准确和应用广泛的乙醇分析方法倍受重视。 

目前产乙醇菌株的筛选方法比较单一，有报道，根据TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)的显色反应进行筛选。TTC是一种显色剂，氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲臢(TPF)，TPF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化。TTC能够被微生物代谢过程中的脱氢酶氧化，发生显色反应，但是TTC只能说明菌株具有脱氢酶或脱氢酶活性的高低，不能说明是否能够产生乙醇。 

另外，乙醇和C3-C6正烷醇均可用液相色谱和气象色谱法检测，但是这两种检测方法样品的前处理过于麻烦，且仪器价格比较昂贵，操作繁琐，由此可见目前的筛选方法和乙醇及C3-C6正烷醇检测方法都不适用于高通量筛选产各种醇的菌株，寻求一种简便、快速、准确的方法检测各种正烷醇，对于高通量筛选合适菌株生产乙醇和高级正烷醇具有重要意义。 

发明内容

【本发明的目的】 

本发明的目的在于提供一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的新方法。通过醇氧化酶和过氧化氢酶偶联的方法测定乙醇和C3-C6正烷醇，高通量筛选目标微生物。与传统微生物筛选方法相比，基于双酶偶联反应的高通量筛选方法成本低、效率高、目的性更强，能够从广泛的自然界中筛选性能优良的菌株。 

【本发明的思路】 

利用醇氧化酶和过氧化氢酶偶联的方法，测定乙醇和C3-C6正烷醇含量。 在氧气存在条件下，醇被醇氧化酶氧化，形成醛和过氧化氢，形成的过氧化氢与4-安替比林和苯酚在过氧化氢酶作用下形成一种红色物质醌亚胺。醌亚胺是一种红色物质，在500nm处有特征吸收值。微生物代谢产生乙醇和其他C3-C6的有机醇，通过96孔酶标板和微孔读板器，利用双酶偶联方法分析检测代谢产物，筛选高产各种醇的菌株，为基础研究提供宝贵的菌种资源。 

【本发明的技术路线】 

本发明的技术路线如下： 

(1)利用培养基将筛选样品进行富集培养48h； 

(2)将富集培养的混合菌利用无菌水进行稀释(获得单菌落)，涂布到固体培养基，培养48h；