[发明专利]酶法检测肌酸激酶试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物试剂，具体涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种酶法检测肌酸激酶试剂盒及其制备方法。

背景技术

肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。肌酸激酶在临床上主要用于诊断心肌梗塞。心肌梗塞患者发病后2-4小时，血液中此酶活动即开始升高。比血清中谷草转酸酶和乳酸脱氢酶的活力变化都出现得早。此酶是继转氨酶后至今临床上最重要的酶，特别是在诊断心肌梗死上有较高价值。和常用的谷草转氨酶、乳酸脱氢酶相比，有下列优点：肌酸激酶最先升高，疼痛出现后4小时肌酸激酶急剧上升，最高可达正常上限的10～12倍，是目前最敏感的酶试验。因肝中肌酸激酶含量很少，心脏疾病伴有肝郁血或肝损伤时，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氨酶往往升高而肌酸激酶无变化，特异性较强。红细胞中此酶活力很低，溶血标本对此酶测定干扰较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶小，已成为临床化学方面常用酶之一，每年全世界约进行一亿次肌酸激酶测定。在心肌梗死病程中，如肌酸激酶活力再次升高，往往说明心肌再次梗死。但此酶活力增高持续时间短，2～4天后就可恢复正常。所以如用此酶诊断心肌梗死，一定要注意病程时间。发病时间较长的病例，应测定能较长维持增高的酶活力的乳酸脱氢酶，此时肌酸激酶活性正常并不能否定心肌梗死诊断。另一方面，肌酸激酶可用于肌肉疾病诊断。在Duchenne肌萎缩患者血中，肌酸激酶极度增高，甚至可高出正常值上限50倍，而后随病程延长下降。此病是和性染色体有关的遗传病，在无症状的女性，隐性携带者约75％肌酸激酶也高于正常。其他类型的原发性肌萎缩患者肌酸激酶也有不同程度的升高，这可用于区别继发性肌病如神经性或废用性肌萎缩，此时肌酸激酶活力往往正常。此外，肌酸激酶还可用于脑疾病诊断。高肌酸激酶活力常见于发作性癫痫、破伤风。肌酸激酶增高也见于器质性神经疾病，如脑梗死、脑膜炎和脑炎等。

肌酸激酶检测方法：

由于肌酸激酶的巯基很容易失活，检测时候要用带巯基的物质来激活巯基，常用的物质有N-乙酰半胱氨酸，巯基乙醇，硫代甘油等。但是巯基在试剂中极不稳定，很容易失活。需要用很多方法来保护巯基。

专利文献报道了很多稳定巯基化合物的方法，包括充氮气，加巯基保护剂等，但是还有缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计稳定肌酸激酶的巯基，提高试剂稳定性。

本发明提供了一种酶法检测肌酸激酶试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和试剂2，按4份∶1份的比例组成：

试剂1：(1L)(试剂体积)，由下列重量配比的成分组成：

去离子水加至1L。

试剂2：(1L)(试剂体积)，由下列重量配比的成分组成：

去离子水加至1L。

本发明检测肌酸激酶试剂盒，在使用时，试剂1(200微升)加检测样本后(10微升)，再加入50微升试剂2，即可进行检测。

本发明的另一目的是提供了肌酸激酶试剂盒的制备方法：该方法包括下列步骤：

(一)制备试剂1：(1L)(试剂体积)

(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；

(2)依次加入咪唑、醋酸镁、N-乙酰半胱氨酸、羟基亚乙基二膦酸、叠氮钠、辅酶I、岩藻糖、D-葡萄糖；

(3)加入己糖激酶；

(4)最后加入剩余量的去离子水至总体积为1L混合均匀，即得；

(二)制备试剂2：(1L)(试剂体积)

向容器内依次加入咪唑、羟基亚乙基二膦酸、单磷酸腺苷、二钠盐

二磷酸腺苷，一钾盐、二(5-腺苷)五磷酸，锂盐、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸肌酸叠氮钠，去离子水加至总体积为1L混合均匀，即得。

本发明人经过研究试验，在试剂盒中加入了巯基保护剂羟基亚乙基二膦酸和丙醇，比现有的的保护剂乙二胺四乙酸稳定性好。