[发明专利]一种锦鲤鳍条组织细胞系及构建方法

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖病害防控技术领域，具体涉及一种锦鲤鳍条细胞系，同时还涉及一种锦鲤鳍条细胞系的构建方法，适用于淡水鱼类细胞系建立与鲤疱疹病毒病原的分离培养及诊断。

背景技术

锦鲤(Cryprinus carpiod)，以其绚丽的色彩、华丽的斑纹、雄健的身躯、温顺的习性而享誉世界，被人们称为“水中瑰宝”、“会游泳的艺术品”，是世界上最受欢迎的大型观赏鱼之一。锦鲤除具观赏价值外，还是营养丰富、肉质细嫩的食用鱼。

近年来，随着环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀，锦鲤的病害问题日趋严重，各种传染性疾病尤其是病毒病的暴发，造成锦鲤死亡率逐年上升，极大地影响了锦鲤养殖业、观赏业、国际贸易出口业，经济损失严重。锦鲤疱疹病毒病由锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus，KHV)引起，主要感染锦鲤和鲤鱼，是锦鲤和鲤鱼养殖生产中发生的一种高致病性疾病，发病率和致死率均可高达80％-100％。1998年在以色列的Magan Michael地区暴发了锦鲤疾病，经鉴定其病原为KHV，导致渔场损失肉用鲤鱼600吨，出口损失近400万美元。随后该病传播与蔓延到美国、欧洲大陆、亚洲等；近年来我国已有该病毒病例的报道。KHV非常特殊，只能在源自于原始宿主细胞中增殖，即在锦鲤细胞中增殖，很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中增殖。目前，国外常用锦鲤鳍条细胞系KF-1和普通鲤鱼脑细胞系CCB进行该病毒培养，但国内未见报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种锦鲤鳍条组织细胞系的建立方法，即通过组织块移植法建立一种锦鲤鳍条细胞系。组织块的存在，为迁出细胞提供了良好的生长基质和环境，对适应培养环境和促进细胞生长有重要作用，从组织块中迁移出来的细胞贴壁稳定、生长迅速，可生长成稳定的单层细胞；该方法具有操作方便、快速、效率高等特点，是常用的细胞原代培养方法之一。目前锦鲤疱疹病毒不仅感染锦鲤，而且已经在我国较大的范围内感染养殖鲤鱼，造成重大经济损失。在开展锦鲤疱疹病毒病原分离鉴定、疫病诊断与防控技术研究中，缺乏锦鲤疱疹病毒的敏感细胞系。本发明工艺科学合理，经这种方法建立的锦鲤鳍条细胞系，目前已传至60多代，对锦鲤疱疹病毒敏感，可望今后应用于锦鲤疱疹病毒的分离鉴定、病毒体外扩增、疫病诊断、病毒疫苗制备以及锦鲤疹病毒病的基础理论研究与免疫防治技术等方面的研究。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种锦鲤鳍条组织细胞系(Koi-Fin)的构建方法，其步骤是：

1.锦鲤鳍条组织块的制备：首先将锦鲤放置在浓度为15-25克/升的高锰酸钾溶液中，消毒处理30-40min后再用70％(V/V)酒精擦拭鱼体表面，在II级生物安全柜(新加坡，ESCO)里无菌取出背鳍、腹鳍组织。用含450-550单位/毫升青霉素(Sigma)、450-550微克/毫升链霉素(Sigma)、12.0-13.0微克/毫升两性霉素B(Sigma)的磷酸缓冲液洗涤鳍条组织3～4次，用灭菌的眼科剪子将鳍条组织剪成约1mm³左右的碎块，均匀移植到25毫升细胞培养瓶(Coring)里，于23-25℃培养箱里倒置干贴1.5-2.5小时。

2.锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液的配置：取6.8-7.2毫升pH值为7.0-7.4的MEM培养基(Sigma)，加入1ml胎牛血清(Hyclone)，为了促进锦鲤鳍条组织细胞的分裂和快速增殖，在上述培养液中添加0.01‰-0.02‰(W/V)的碱性纤维生长因子、0.01‰-0.02‰(W/V)表皮生长因子。

3.锦鲤鳍条组织细胞的原代培养：将每瓶干贴后鳍条组织中添加专用增殖培养液，于23-25℃培养箱里培养，待观察到细胞从鳍组织周围迁出后，每隔3-5天半量更换锦鲤鳍条组织专用增殖培养液，即用移液管从每个细胞培养瓶里吸出2.5ml培养液，以去除未贴壁的组织块以及死细胞，并添加2.5ml新鲜的锦鲤鳍条组织细胞专用增殖培养液。