[发明专利]猪睾丸克隆细胞系及其生产猪瘟活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物细胞生产猪瘟活疫苗的方法及产品，特别是指一种使用猪睾丸克隆细胞系生产猪瘟活疫苗的方法及产品。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，死亡率高达80-90％。猪瘟被世界世界动物卫生组织划分为A类疾病，我国将其划分为一类疾病。中国学者培育成功的猪瘟兔化弱毒苗是目前世界上公认的安全和有效的疫苗，借助于C株疫苗密集接种和综合防制措施，有关国家已经有效地控制了猪瘟，甚至消灭了猪瘟。在我国，猪瘟流行出现典型猪瘟与非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等，因此，猪瘟新的流行形式给我国养猪业防治本病提出了新的挑战。

疫苗接种仍是我国目前防治猪瘟的主要措施，我国目前生产猪瘟兔化弱毒苗用的细胞有牛睾丸细胞、猪肾细胞(IBRS-2或PK15细胞系)、猪睾丸细胞(ST细胞)。但在该疫苗生产实践中证实用上述细胞生产的疫苗，其病毒滴度不高，生产工艺不稳定，特别是病毒滴度随细胞传代数的增加迅速降低，导致疫苗批次之间的差异很大。

此外，由于牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒同属于黄病毒科瘟病毒属，两种病毒的同源性很高，因此污染了BVDV的牛睾丸细胞或犊牛血清都会造成疫苗污染，而我国牛群中病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染率很高，用这样的动物细胞生产的猪瘟活疫苗免疫猪，往往造成免疫失败，引起严重的后果。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪睾丸克隆细胞，及其生产猪瘟活疫苗的方法及产品。

本发明提供的一种高感染猪瘟病毒的猪睾丸克隆细胞，命名为猪睾丸细胞系(swine testicular cell lines)克隆株ST-B2，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2011101，保藏日期为2011年11月07日。

本发明中猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞，是指对猪瘟病毒感染高的猪睾丸克隆细胞，特别指可以生产高滴度的猪瘟病毒的猪睾丸克隆细胞，也即指可以生产高效价的猪瘟活疫苗的猪睾丸克隆细胞。

本发明还提供了一种如上所述的猪睾丸克隆细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将猪睾丸细胞进行有限稀释进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株；

2)选择对猪瘟病毒感染率最高的猪睾丸细胞的亚克隆株即为猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞。

优选地，本发明如上所述的使用猪睾丸克隆细胞的制备方法中，所述的步骤1)为使用未被病毒感染的猪睾丸细胞，经胰蛋白酶消化为单细胞后进行梯度稀释，分别在37℃ 5％CO₂的条件下培养于96孔细胞培养板中培养至肉眼可见细胞克隆后，进行亚细胞培养，获得亚克隆细胞株；

优选地，本发明如上所述的使用猪睾丸克隆细胞的制备方法中，所述的步骤2)为将猪睾丸细胞亚克隆株接种于96孔细胞培养板中，接种猪瘟病毒于37℃ 5％CO₂的条件下培养2h，使用免疫过氧化酶单层细胞试验法检测感染病毒最多的细胞，选择对猪瘟病毒感染率最高的猪睾丸细胞的亚克隆株即为猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞。

本发明还提供了一种如上所述的猪睾丸克隆细胞用于高滴度的猪瘟病毒液的制备方法，将上述的猪睾丸克隆细胞用胰酶消化后，同步接种含新鲜脾毒的细胞维持液，37℃含5％CO₂温箱中培养2-3d，待细胞长满单层后，按照1∶3的比例传代，同时收获传代细胞的上清病毒液即可获得高滴度的猪瘟病毒液。

优选地，本发明如上所述的高滴度的猪瘟病毒液的制备方法中，所述传代次数为可以大于15代。

优选地，本发明如上所述的高滴度的猪瘟病毒液的制备方法中，所述的病毒滴度为大于10^6.0TCID₅₀/ml。

本发明还提供了一种使用如上1所述的猪睾丸克隆细胞生产猪瘟活疫苗的方法，包括以下步骤：

1)生产用种子批病毒液的制备：将权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞用胰酶消化后，同步接种含新鲜脾毒的细胞维持液，37℃含5％CO₂温箱中培养2-3d，待细胞长满单层后，按照1∶3的比例传代2次，同时收获第二代、第三代的传代细胞的上清病毒液即可获得高滴度的猪瘟病毒液；