[发明专利]一种玻璃酸钠的酶解方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种玻璃酸钠的酶解方法。

背景技术：

玻璃酸(hyaluronic acid，HA)是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，其重均分子量一般为10万～1000万Da，分子中两种单糖的摩尔比为1∶1。

目前，酶解法制备低分子量HA和寡聚HA主要采用玻璃酸酶，其最适反应条件是：底物浓度为10g/L，酶浓度为150000U/L，反应液的pH值为5.0，反应温度为50℃；如需制得分子量为1×10⁴的HA，酶解时间为3h。控制反应时间，可制得不同分子量的HA，但是，目前酶活力为50万u/g的医药级产品市场价为60万元/Kg，致使用玻璃酸酶酶解玻璃酸的成本过高。

另外，不同微生物来源的乳糖酶糖苷键键型作用存在特异性，实验研究表明米曲霉乳耱酶的水解优先顺序是β-l-6键＞β-1-4键＞β-1-3键.乳酸克鲁维酵母乳糖酶的水解顺序则是β-l-4键＞β-1-6键＞β-1-3键，而环状芽孢杆菌对β-1-4键具有高度的键专一性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种反应条件温和，生产成本低的玻璃酸钠的酶解方法。

为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：

一种玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将玻璃酸钠溶解在pH值为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中得溶液A；

(2)将步骤(1)所得的溶液A中加入β-半乳糖苷酶，于35-50℃酶解60-320min后，加热至70-85℃使酶失活，加热时间为8-12min得酶解液；

(3)将步骤(2)所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。

在本发明的一优选实施例中，所述步骤(1)中，1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为5-10g，更优选为1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为10g。

在本发明的一更优选实施例中，所述步骤(1)中，磷酸盐缓冲液pH值为6.4。

在本发明的一优选实施例中，所述步骤(2)中，1L溶液A中加入酶的量为100000-2500000U，更优选为1500000U。

在本发明的一更优选实施例中，所述步骤(2)，酶解温度为50℃。

在本发明的一更优选实施例中，所述步骤(2)，快速加热至75℃使酶失活，加热时间为10min。

在本发明的一优选实施例中，所述的β-半乳糖苷酶的微生物来源为环状芽胞杆菌。

在本发明的一优选实施例中，所述步骤(3)中，用氯代烷基十六吡啶进行络合。

本发明与玻璃酸酶酶解玻璃酸钠的最佳酶解条件：反应液pH值5.0，反应温度50℃相比，β-半乳糖苷酶的酶解条件：反应液pH值6.0-7.0，反应温度35-50℃更温和。

此外，虽然制得相同分子量玻璃酸钠，所需β-半乳糖苷酶的酶用量要大于玻璃酸酶，但是同级别酶，每单位酶活力(U)的价格，玻璃酸酶价格为β-半乳糖苷酶的百倍以上，(医药级产品市场价：β-半乳糖苷酶，酶活力5万u/g，500元/Kg；玻璃酸酶，酶活力50万u/g，60万元/Kg)。因此，本发明能够大大降低制备低分子量玻璃酸钠及其寡糖的生产成本。

具体实施方式：

通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1

取0.2g玻璃酸钠，分子量为118万Da，溶解于装有100ml pH值为6.0磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为2000000U/L，于温控为45℃的水浴振荡器内酶解210min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。

实施例2

取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.0磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为100000U/L，于温控为45℃的水浴振荡器内酶解180min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。

实施例3