[发明专利]一种斜带石斑鱼抗菌肽的原核表达产物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的鱼类基因工程表达，尤其是涉及一种斜带石斑鱼抗菌肽Hepcidin3的表达载体和表达产物及其构建制备方法。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是鱼类先天免疫系统的重要组成成分，鱼类可分泌产生多种抗菌肽来抵抗水生环境中大量的病原微生物的侵袭，这些病原微生物包括多种细菌、真菌和病毒等等。利用分子生物学技术，在体外获得大量的、有活性的抗菌肽产品，进一步应用这些抗菌肽产品可能增强水产动物的免疫力，提高养殖产量，并对解决海水养殖中面临的由于长期滥用抗生素而引起的细菌耐药性、水产品药物残留和水环境污染等问题具有重要的科学、现实和经济意义。

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides，orange-spotted grouper)俗称青斑，是暖水性中下层鱼类，主要分布于印度洋、红海、地中海、北太平洋西部和东南亚地区。其肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快、体色艳丽，市场价格高且稳定，目前斜带石斑鱼已成为世界上育苗量和人工养殖产量最高的石斑鱼类，也是我国福建、广东、海南、台湾四省重要的海水养殖鱼类之一。但是近年来，由于致病性微生物引起的鱼病爆发，使得斜带石斑鱼养殖业承受着巨大的经济损失(1.林建辉.斜带石斑鱼的生物学特性及养殖技术[J].齐鲁渔业，2008，25(2)：22-23；2.黄瑞芳.斜带石斑鱼溶藻弧菌病的研究[J].水产科学，2005，24(6)：1-3；3.梅冰，周永灿，徐先栋，王世峰，谢珍玉.斜带石斑鱼烂尾病病原菌的分离与鉴定[J].热带海洋学报，2010，29(6)：118-124)。

本申请人在前期研究中从青石斑鱼(Epinephelus awoara)中克隆获得了1个成熟肽具有4个半胱氨酸残基的hepcidin基因，继而从福建漳浦的养殖斜带石斑鱼中克隆得到了另1个新的成熟肽含有4个半胱氨酸残基的hepcidin基因，与已报道的另外2个在斜带石斑鱼中发现的hepcidin基因EC-hepcidin1和EC-hepcidin2具有同源性，推测是其变体，故命名为EC-hepcidin3。已发现人工合成的EC-hepcidin1和EC-hepcidin2的成熟肽具有抗菌、抗病毒的作用(4.Jing-Geng Zhou，Jing-Guang Wei，Dan Xu，Hua-Chun Cui，Yang Yan，Zheng-Liang Ou-Yang，Xiao-Hong Huang，You-Hua Huang，Qi-Wei Qin.Molecular cloning and characterization of two novel hepcidins from orange-spotted grouper，Epinephelus coioides[J].Fish&Shellfish Immunology，2011，30：559-568)。

同其他已发现的鱼类hepcidin结构一样，EC-hepcidin3包括内质网靶向的位于N端的信号肽，前导肽和位于C端的成熟肽，其中前导肽和成熟肽共同构成前体肽(propeptide of EC-hepcidin3，EC-proHep3)。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种斜带石斑鱼抗菌肽的原核表达产物及其制备方法。

本发明构建的一种含有EC-hepcidin3基因的表达载体可在大肠杆菌中诱导表达，并通过高效纯化表达产物而在体外获得大量的表达产品。所述含有EC-hepcidin3基因的表达载体，是在原核表达载体pET-28a⁺中插入EC-hepcidin3前体肽基因序列所构成的重组表达载体pET28a/EC-hepcidin3。

本发明所述在体外获得的表达产物，是重组表达载体pET28a/EC-hepcidin3在大肠杆菌中经诱导表达以及纯化后获得的重组蛋白EC-proHep3。

所述EC-hepcidin3前体肽的基因序列如序列表第1序列所示。

所述EC-hepcidin3前体肽的氨基酸序列如序列表第2序列所示。

所述重组蛋白EC-proHep3的制备方法包括以下步骤：

1)构建重组表达载体；

2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，获得可表达EC-proHep3的基因工程菌菌株；

3)发酵培养已得到的基因工程菌菌株并进行诱导表达，获得表达产物；

4)分离纯化步骤3)所得的表达产物，获得重组蛋白EC-proHep3。