[发明专利]一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种杀线虫真菌及其制备方法与应用。

背景技术

植物寄生线虫是一类重要的病原微生物，分布广、种类多，全世界已报道的植物线虫有200多属5000余种，给农林业生产造成严重为害(冯志新，2001)。据估计全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失达780亿美元(Barker et al，1998)。就现今危害最为严重的线虫种类——根结线虫而言，其有着广泛的寄主，且为世界性分布，每年可给全球作物总产量造成10％以上的损失(Whitehead，1998)。

植物线虫具有隐蔽性、多寄主性、顽固性、易传播的特点，其种群增长迅速，给防治上带来了诸多的困难。自从20世纪40年代化学技术的革命后，化学杀虫剂被广泛用于农林业生产，并在害虫防治中占居重要地位，与此同时，由于人们长期过分依赖化学农药，且缺乏生态意识，造成了严重的环境污染。杀线虫剂多为高毒力高残留化学农药，这些药物对人畜不安全，对环境污染严重，并易使线虫产生抗药性，对有益生物杀伤力强。

随着人们环保意识的增强，对健康食品要求的日益增高，以往用于植物线虫防治的高毒农药多以法律的形式给予了禁用，人们将研究重点转向了生物防治。生物防治具有对人畜安全，对环境友好等优点，因此，生物防治方法在植物线虫病害的防治地位尤显重要。

目前木霉是多种植物病害包括根结线虫病的重要生防菌，绿木霉是重要的生防木霉之一，研究开发绿木霉对防治植物寄生线虫具有重要意义。目前关于绿木霉的相关技术报道有限，市场上无来源于木霉菌尤其是绿木霉菌的用于防治线虫的商品生防制剂，尚属技术空白。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一株新的具有杀线虫功能的绿木霉真菌。

本发明的另一个目的是提供所述绿木霉的分离方法。

本发明的另一个目的是提供所述绿木霉的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述绿木霉的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供一株具杀线虫活性的绿木霉，本申请人从广东省深圳湾红树林根际土样中分离得到一株对线虫具有很好毒杀作用的绿木霉(Hypocrea virens H22，缩写为H.virens H22)，菌株于2011年9月2日保存于中国湖北武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2011303。

所述绿木霉菌株的分离方法为：在CMA平板上撒1.0g土样，接入约1000条南方根结线虫二龄幼虫，25℃培养3天(d)后，镜检并用针挑取死虫体上及其周围单个的真菌分生孢子于含硫酸链霉素50ppm的CMA平板上，纯化获得真菌；所述CMA培养基为：20g玉米粉，15g琼脂粉，1000ml水。

所述绿木霉(H.virens H22)的菌株形态特征为：在PDA上初期为白色，中期颜色逐渐变为浅绿色，有发达的气生菌丝，后期产生大量的分数孢子梗及分生孢子，分生孢子梗对生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多个分生孢子粘聚成球形的孢子头。

本发明进一步对绿木霉进行分子鉴定，扩增靶标序列为ITS区，ITS序列如表SEQ ID NO：1所示。

本发明同时提供了所述绿木霉(Hypocrea virens H22)的制备方法，包括固体培养基培养或液体培养基培养方法。

所述固体培养基配方为：马铃薯琼脂培养基(PDA)：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，1000ml水；培养方法为将绿木霉(H.virens H22)菌丝体接种到PDA培养基上，用封口膜封口后于25～28℃下培养2～3天。

所述液体培养基配方为CMA培养液，配方为：玉米粉20g，蒸馏水1000mL。培养方法为在每个500mL三角瓶装200mL CMA培养液，121℃下湿热灭菌20min，冷却后每瓶接入5片活化后的绿木霉菌圆片，在180rmp27℃下暗培养8d后，在4℃条件下12000rmp离心10min得上清液。上清液可保存于4℃冰箱中待用。

本发明提供了所述绿木霉(H.virens H22)的应用，根据其对线虫的显著活性，提供其在杀灭植物寄生线虫方面的应用，并具体提供了杀线虫药剂试验结果。