[发明专利]用羟胺切割法制备天蚕素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途

权利要求书

1.一种含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白，其特征在于天蚕素AD和蛙Buforin II的之间引入羟胺切割位点，并直接相连。

2.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白，其特征在于：在天蚕素AD和蛙Buforin II之间以及天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白N端序列之前各引入一个羟胺位点Asn-Gly，从而使大肠杆菌表达融合蛋白可以使用羟胺来切割释放天蚕素AD和蛙Buforin II。

3.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白的制备方法，其特征在于设计人工合成四对引物，通过3轮PCR，合成天蚕素AD和蛙Buforin II的融合基因-CAD-Buforin II基因。

4.如权利要求3所述含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白的制备方法，其特征在于所说的四对引物的序列如序列2-8所示。

5.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白的表达质粒，其特征在于由质粒pET-Trx与人工合成的CAD-Buforin II基因片段，用BamH I和EcoR I双酶切，连接而成的质粒pET-Trx-CAD-Buforin II，其N端有3个His形成立体His-patch，序列中有2个羟胺切割位点，有利于表达纯化。

6.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白的表达工程菌株，其特征是由表达质粒pET-Trx-CAD-Buforin II转化E.coli BL21细胞获得的最高表达量的菌株，该菌株为已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Trx-PC6/BL21，保藏号为CGMCC No.4588。

7.应用权利要求1所述含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白，制备天蚕素AD和蛙Buforin II复合抗菌肽的方法，其特征在于包括融合抗菌肽CAD-Buforin II的大规模表达、提取、分离纯化、羟胺切割裂解各步骤，制得含有天蚕素AD和蛙Buforin II的复合抗菌肽。

8.如权利要求7所说的准备复合抗菌肽的方法，其特征在于所说的羟胺切割条件为：加入盐酸羟胺浓度至1-4M，调pH值至7.0-9.5，在35-50℃下，切割1-12个小时。

9.如权利要求7所准备的天蚕素AD和蛙Buforin II复合抗菌肽的用途，其特征在于用于药物和饲料添加剂。