[发明专利]一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物源农药生产技术领域，尤其涉及一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用。

背景技术

农作物病害引起的损失幅度约占总产量的25～75％，以我国主要的粮食作物水稻为例，每年种植面积约4亿亩，按亩产量400公斤，水稻病害平均引起减产10％计，每年造成经济损失达300多亿元人民币之巨，严重威胁粮食作物的安全生产。目前，生产上控制植物病害除了选用良种和改进栽培措施外，主要依靠喷洒化学杀菌剂。目前使用的大多化学杀菌剂对人体和动物具有不同程度的毒害作用，残留在植物可食部分的有害成份会对人体健康造成潜在威胁，已经引起政府和社会各阶层的关注；不仅如此，有些化学农药难以分解，会长期地累积在生态系统中，造成对环境的污染，不利于社会经济的可持续发展；而且，现有的化学农药对某些植物病害并不完全有效。因此，在努力发展新一代化学农药的同时，还需要大力研究和发展高效、安全、经济、对环境相容性好的生物源农药。目前，在生产上已经推广使用的生物源农药，其种类和数量都较少，有些品种则由于使用年久，引起了植物病原菌的抗药性，防治效果不够理想。以水稻纹枯病为例，防治该病害的药剂主要依赖于老牌生物源农药井岗霉素。但是，经过将近40年的长期使用，部分水稻纹枯病菌的融合群已产生抗药性；而且，井岗霉素仅对水稻纹枯病菌有效，对其他病原菌没有明显的防治效果，使用范围具有很大的局限性。

生物农药促生拈抗菌M18，对植物病害具有高效、安全、广谱的杀菌作用，与环境相容性好，易于在环境中解体。该促生拈抗菌M18已于2000年6月27日在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNO.0462。生物农药促生拈抗菌M18的制备和应用，已经获得国家发明专利，专利号为00119857.2。但是，生物农药促生拈抗菌M18是一种活菌菌剂，其作用机理主要是通过M18活菌合成抗植物病害的活性成分实现对农作物植物病源菌的抑制作用，其合成的活性成分含量容易受到菌体本身的代谢调控机制和环境条件的影响。因而，对植物病害的防治效果具有不稳定性的缺陷，难以在农业生产中进行大规模的推广应用。

已经查明，促生拈抗菌M18防治植物病害的主要活性成分是吩嗪-1-羧酸，从促生拈抗菌M18的发酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分而不是活菌对农作物病害的防治同样具有高效、安全、广谱、与环境相容性好等特征；同时，能克服利用促生拈抗菌M18防治病害效果不稳定性的缺陷。但是，利用促生拈抗菌M18发酵，合成活性成分吩嗪-1-羧酸的效价很低，仅为每升200毫克左右，如何提高发酵效价，降低使用成本，成为开发本产品的瓶颈所在。近年来，我们已经运用分子生物学的技术，对促生拈抗菌M18合成吩嗪-1-羧酸的调控机制，开展深入地研究。在此基础上，运用基因工程手段，对促生拈抗菌M18基因组中的双组分调控基因gacA开展了定向失活突变，获得了M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的产量，使其发酵效价达到每升1500-1700毫克左右。该研究成果的技术方法已经于2004年在《微生物学报》44卷第761～765页公开，论文题目为《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控》。在2006年，名称为“利用促生拈抗菌M18衍生菌株制备杀菌剂的方法”的中国发明专利中(专利号：ZL200610023459.9)，提供一种了利用促生拈抗菌M18衍生菌株M18G和M18R制备杀菌剂的方法，利用微生物的代谢产物而非微生物活体制备杀菌剂，通过两种衍生菌株的代谢产物的复配，达到提高防治效果的目的。2009年，我们又发明了利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，能使吩嗪-1-羧酸的发酵效价达到每升5700～6600毫克的水平，进一步降低生产成本，实现在农业生产的大规模推广应用。该项技术已经获得国家发明专利，专利号：ZL200910198664.2。以吩嗪-1-羧酸为主要成分的微生物源杀菌剂，我国农药命名单位已经定名为申嗪霉素。申嗪霉素原药和1％申嗪霉素悬浮剂于2011年获得了农业部颁发的正式登记证(登记号：PB20110314和PB20110315)。农业部已经将申嗪霉素列入“十二五”期间全国推广产品(证书号：TG2011-002)。

但是，吩嗪-1-羧酸对病源菌的防病作用与使用时的酸度(pH)值密切相关，在pH值7.0的条件下，其抗菌活性仅为pH值5.0条件下的20％，大大降低了吩嗪-1-羧酸在碱性条件下的防病效果。同时发现，促生拈抗菌M18及其衍生菌株M18G的基因组中，phzH基因是一个已经发生突变的失活基因。