[发明专利]鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种利用100K重组蛋白鉴别I群禽腺病毒感染的动物与经免疫接种I群禽腺病毒灭活疫苗的动物的间接ELISA方法。

背景技术

I群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I，以下简称FAVI)归于腺病毒科禽腺病毒属，具有共同的群抗原，基于hexon基因序列，分为5个不同的种(A-E)，基于中和试验结果，细分为12个血清型。FAVI在世界范围内普遍存在，宿主较多在鸡、鸭、鹅体内，可从健康和发病的家禽中分离出。该病既可经排泄物水平传播，也可经卵垂直传播，污染鸡胚。近年来，由FAVI引起的包涵体肝炎、心包积液肝炎综合征和砂囊糜烂等疾病，对肉鸡的生产及种鸡的培育带来一定的威胁，因而引起养殖业对该病的预防和控制。FAVI较多的是在体内复制而不发病，动物感染该病毒后，呈隐性感染，与其他病原共同作用于家禽。FAVI的灭活苗免疫后，如能建立一种区分FAVI免疫动物和感染动物的间接ELISA方法，对防控、净化和消灭该病具有至关重要的作用。

目前，检测FAVI的血清学方法主要有琼脂免疫扩散、中和试验、免疫荧光、对流免疫电泳、间接血凝反应和Southern杂交等。这些方法耗时、费力，不适合大批量的检测血清样品，而且使用的抗原较多为全病毒，存在散毒的危险。

100K是FAVI的非结构蛋白，是FAVI感染后期中含量最丰富的蛋白质，能与最新合成的最主要结构蛋白hexon结合，使后者发生卷曲并折叠成同源三聚体，同时能使hexon从细胞浆内质网转运到细胞核进行装配。100K还能与腺病毒晚期mRNA结合，以促进病毒蛋白的合成，同时抑制宿主蛋白的合成。

本发明所述100K重组蛋白的间接ELISA鉴别诊断方法建立的基本原理是病毒非结构蛋白只在病毒复制增殖过程中表达，刺激机体产生非结构蛋白抗体。目前在疫病防制中采用的灭活疫苗，在制备过程中破坏了绝大多数非结构蛋白，因此用灭活苗免疫动物，理论上动物体内就只有结构蛋白抗体而极少有甚至用现有方法检测不到的非结构蛋白抗体。而动物感染野毒后，病毒在体内复制、增殖的过程中就有非结构蛋白的表达，因此可以利用非结构蛋白抗体的存在与否来区分感染动物和灭活苗免疫动物。大量研究表明，利用病毒非结构蛋白建立的ELISA方法能区分感染与灭活苗免疫产生的抗体，如Raue R等利用牛病毒性腹泻NS基因建立商品化ELISA试剂盒，以区分感染和灭活苗免疫产生的抗体；我国台湾学者Shu PY等利用乙型脑炎非结构蛋白NS1建立区分感染和免疫抗体的间接ELISA方法；Bruderer U等利用重组蛋白3ABC建立区分口蹄疫自然感染和疫苗免疫的抗体的ELISA方法；Makkay AM等利用新城疫NP基因建立区分自然感染和HN基因亚单位疫苗鸡抗体的ELISA方法；LaviadaMD等构建非洲马病NS3基因重组菌，区分自然感染和灭活苗免疫的方法。但是，目前尚无利用100K重组蛋白鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法的研究报道。

发明内容

本发明是针对上述领域中的不足，提供了一种利用100K重组蛋白鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，该方法特异性强，操作简单，耗时短，成本低，可大批量检测样品。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，是以FAVI 100K重组蛋白为包被抗原，鸡血清为检测样品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为酶标二抗来检测I群禽腺病毒感染产生的抗体。

所述包被抗原是经如下步骤制备：

(1)FAVI 100K重组蛋白的原核表达：以FAVI CELO毒株的DNA为模板，用特异性引物PCR扩增100K(GenBank：U46933：23671-24732nt)目的基因，目的基因克隆于pGEX-4T-1原核表达载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。根据氨苄青霉素抗性提取克隆，快速提取转化子的质粒DNA，双酶切鉴定，得到与目的片段分子量一致的片段，判为阳性结果，命名为100K-pGEX。阳性质粒送大连宝生物公司测序，结果表明FAVI 100K重组蛋白目的基因序列已正确连入pGEX-4T-1，大小为1062bp，推算蛋白质分子量为38.9ku，pGEX-4T-1载体本身表达的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的分子质量为25.6ku，因此，FAVI 100K重组蛋白的分子量为64.5ku，100K基因部分序列扩增的引物如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCTCATCGAAAATGGCAGACAAGAT-3’，插入EcoR I酶切位点；