[发明专利]鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法

权利要求书

1.一种鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于：以FAVI 100K重组蛋白为包被抗原，鸡血清为检测样品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为酶标二抗来检测I群禽腺病毒感染产生的抗体。

2.根据权利要求1所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于所述包被抗原是经如下步骤制备：

（1）FAVI 100K重组蛋白的原核表达：以FAVI CELO毒株的 DNA为模板，扩增100K基因前段核苷酸序列GenBank:U46933:23671-24732nt，克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中，在大肠杆菌DH5α中表达，100K基因部分序列扩增的引物如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCTCATCGAAAATGGCAGACAAGAT-3’，插入EcoR I酶切位点；

下游引物：5’-ATTTGCGGCCGC CCCGAGACGCCATTTAGGTA-3’，插入Not I酶切位点；

（2）对FAVI 100K重组蛋白反应原性的鉴定；

（3）将鉴定后的FAVI 100K重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖树脂吸附、洗涤、洗脱的亲和层析方法，获得纯化的100K-pGEX重组蛋白，即包被抗原。

3.根据权利要求1所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于：所述鸡血清包括FAVI阴性血清、实验感染血清和灭活苗免疫血清。

4.根据权利要求1或2或3所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）包被：用包被液将包被抗原稀释至1~20μg/mL，包被96孔酶标板，每孔100μL，于37℃温育1h后，置于4℃12~16h，PBST洗板3次，拍干；

（2）封闭：每孔加入封闭液200μL，37℃孵育，封闭1h， PBST洗板3次，拍干；

（3）与血清结合：加入检测样品，100μL/孔，设阴性标准品和阳性标准品为对照，于37℃孵育1h后， PBST洗板3次，拍干；

（4）与酶标二抗结合：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG用稀释液以1:1000~1:8000倍稀释，每孔加入100μL，置于37℃孵育1h后，PBST洗板3次，拍干；

（5）显色：每孔加入100uL底物显色液，于37℃避光作用10min；

（6）终止：每孔加入50uL终止液，终止反应；

（7）结果判定：在酶标仪读取450nm波长处吸光值，即OD450值；

计算FAVI阴性血清的OD450平均值X和标准差SD，FAVI阴性血清的X+3SD作为阴阳性临界值，若检测样品OD450值>阴阳性临界值，判为阳性；若样品OD450值<阴阳性临界值，判为阴性。

5.根据权利要求4所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于：

（1）所述包被液为碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6；

（2） 所述PBST为含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液：NaCl  8.0g，KCl  0.2g，KH₂PO₄  0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O  2.9g，吐温-20  500uL，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到7.4；

（3）所述封闭液为5%脱脂奶，即5g脱脂奶用PBST定容至100mL；

（4）所述稀释液为1%BSA，即1g牛血清白蛋白BSA用PBST定容至100mL；

（5）所述底物显色液为：TMB缓冲液10mL，TMB溶液0.5 mL，H₂O₂  32uL；

（6）所述终止液为2M H₂SO₄，即21.7mL浓硫酸缓慢加入178.3mL蒸馏水中。

6.根据权利要求 4所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于：所述阴性标准品为以SPF鸡胚孵育所产2~5日龄雏鸡的血清。