[发明专利]中华按蚊抗药性AS-PCR检测试剂盒及其专用引物

权利要求书

1.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的引物，由引物组A、引物组B和引物组C组成：

所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3；

所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4；

所述引物组C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列5。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：

所述引物组A还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物组B还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物组C还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1。

3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：

所述引物组A由引物1、2和3组成；

所述引物组B由引物1、2和4组成；

所述引物组C由引物1、2和5组成；

所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C均为独立包装；

所述突变位点为L1014F或L1014C。

4.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的PCR试剂，由试剂A、试剂B和试剂C组成；

所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成；

所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成；

所述试剂C由所述引物组C和PCR缓冲液组成；

所述引物1在其对应的所述试剂中的终浓度均为1.33ng/μl；

所述引物2在其对应的所述试剂中的终浓度为6ng/μl；

所述引物3-5在其对应的所述试剂中的终浓度均为6.67ng/μl；

所述突变位点为L1014F或L1014C。

5.一种制备检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂的方法，包括如下步骤：

1)分别将权利要求1-3中任一所述的引物中的所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C进行独立包装，得到独立包装引物组A、独立包装引物组B和独立包装引物组C；

2)再将步骤1)得到的独立包装引物组A、步骤1)得到的独立包装引物组B和步骤1)得到的独立包装引物组C进行包装，得到试剂；

所述突变位点为L1014F或L1014C。

6.由权利要求5所述的方法制备的试剂。

7.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂盒，为如下1)或2)：

1)所示的试剂盒由试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C组成；

所述试剂盒A为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂A的试剂盒；

所述试剂盒B为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂B的试剂盒；

所述试剂盒C为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂C的试剂盒；

2)所示的试剂盒为含有权利要求6所述的试剂的试剂盒；

所述突变位点为L1014F或L1014C。

8.权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒在检测中华按蚊中kdr基因突变位点、检测中华按蚊抗药性或制备检测中华按蚊抗药性产品中的应用；所述突变位点具体为L1014F或L1014C，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。

9.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的突变位点的方法，包括如下步骤：

用权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A、引物组B和引物组C分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

检测各组引物扩增得到的产物，

若所述引物组B扩增得到169bp产物，且所述引物C未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F；

若所述引物组C扩增得到169bp产物，且所述引物B未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C；

若所述引物组A扩增得到169bp产物，且所述引物组B和所述引物组C均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点。

10.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的基因型的方法，包括如下步骤：

用权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A、引物组B和引物组C分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

检测各组引物扩增得到的产物，

若所述引物组B扩增得到169bp产物，且所述引物A和所述引物C均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F的纯合型基因；

若所述引物组C扩增得到169bp产物，且所述引物A和所述引物B未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014C的纯合型基因；

若所述引物组B和所述引物组C均扩增得到169bp产物，且所述引物A未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因；

若所述引物组A扩增得到169bp产物，且所述引物组B和所述引物组C均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因为不含或候选不含有突变位点L1014F和L1014C的纯合型基因；

所述PCR扩增中，以待测中华按蚊的基因组DNA为模板；

所述PCR扩增的退火温度为55℃-60℃，退火温度具体为55℃；

所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。