[发明专利]生产还原型谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物生物技术领域，涉及发酵产谷胱甘肽的微生物及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，在医学和化妆品，食品加工，蛋白纯化等领域有着广泛的应用[Sies H.(1999)Free Rad Biol Med.27，916-921；Henry Jay Forman et，al，(2009)Molecular Aspects of Medicine 30，1-12；郑云朗(1995)生物学通报30，22-24；Castro，VM.et，al(1993)，Biochem J 292，371-377]。

自上世纪70年代日本协和公司(Kyowa Hakko Kogyo Co.)使用发酵法生产谷胱甘肽工业化以后，发酵法生产GSH就成为其工业生产研究的主要方法[Sakato，K.and Tanaka H.1992，Biotechnol.Bioeng.40，904-912]。为此，上世纪七十年代后，各国开始对生物法合成GSH进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关专利[Kimura A.(1986)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，33，1-51，Nanjo，H.，Yamashita，K.，et.，al(1986)公开特许公报61-52299；Tezuka，H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al(1987)公开特许公报62-275685；Christine，L.，Ulf，S.(1989)Eur.Pat.Appl.EP 300168；王绍校，(2005).中国学位论文全文数据库；饶志明等(2007).应用与环境生物学报，13：257-260；饶志明等(2007)，食品与发酵工业.33：1-4；蔡宇杰等，食品与机械，23，16-19；US Patent 6902912；US Patent 4598046；US Patent 4582801；JP19890032584；WO2004/003217A1；EP1539982；US Patent  20050239164；CN200810019761.6]。其中，发酵菌株的选育主要集中在酵母(如Saccharomyces cervisiae、Pichia pastoris、Candida utilis)和大肠杆菌等微生物，通常的方法是在育种中利用基因重组技术使微生物细胞表达GSH相关合成相关基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gsh1和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破转录调控，使细胞内GSH合成酶活增加，从而提高GSH产量。

谷胱甘肽作为细胞内重要的多功能因子，其合成与调控等机理复杂。

Alfafara等人研究表明，胞内半胱氨酸的浓度是GSH合成产量的限制因素[Alfafara et，al.1992，Appl.microbiol.biotechol.36，358-540]。发酵添加半胱氨酸直接提高GSH的产量[Wen，S.et，al.2004，Enzyme Microbial.tech.35，501-507]。GSH的生产中如果增加细胞内的半胱氨酸相对含量、就可以减少外源半胱氨酸添加量，提高半胱氨酸转化率，生产成本将会大大降低。

发明内容

本发明首先提供一种生产谷胱甘肽的重组菌株。

本发明还提供所述重组菌株的制备方法。

本发明还提供所述重组菌株在发酵生产谷胱甘肽中的应用。

本发明提供的生产谷胱甘肽的重组菌株，其谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。

本发明中谷胱甘肽合成转录调控失调，可以采用组成型或诱导型启动子表达谷胱甘肽相关合成酶，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶正调控蛋白。谷胱甘肽相关合成酶可以选择来源各种生物的谷氨酰半胱氨酸合成酶gsh1或突变体和谷胱甘肽合成酶gsh2或突变体，如：酵母、大肠杆菌、高等动植物等，也可以选择双功能酶gshF或其突变体，如：多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的gshF基因。本发明中谷胱甘肽合成转录调控失调，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶基因转录正调节蛋白(如Yap1p、Met4)启动谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因转录。

优选的，所述的重组菌选择真菌，特别是酵母菌，在本发明中最优选为毕赤酵母。

在本发明重组菌株的一个优选实施方案中，其内源的半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因Str3和/或Str2被失活或敲除，更优选的，Str3基因被失活。