[发明专利]一种耐有机溶剂的产葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产葡萄糖苷酶的芽胞杆菌及其应用，尤其是一种耐有机试剂的产葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌及其应用。

背景技术

α-转移葡萄糖苷酶(α-transglucosidase)又称α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，它可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖或将游离出的葡萄糖残基以α-1，6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(以下简称IMO，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖等)糖脂或糖肽等。在微生物中，细菌、酵母、霉菌等某些菌株能分泌仅.葡萄糖苷酶。已报道的能产此酶的菌种有曲霉，其中以黑曲霉产酶量较高，以及乳酸菌，包括干酪乳杆菌、双歧杆菌等。在动物肠道中也有a.葡萄糖苷酶的分泌，用来帮助消化吸收麦芽糖和麦芽低聚糖，如王志江，魏红福在蜜蜂的腹部组织中分离纯化到α-葡萄糖苷酶。关于嗜热微生物的耐高温α-葡萄糖苷酶基因也已有专利和文献报道。

糖基化合物又称糖苷类化合物或配糖体，在生物，医药，食品等领域均有着广泛的利用价值。在合成糖苷化合物方面，糖苷酶较糖基转移酶来源广泛，比较稳定，能接受不同结构的底物，可直接以非保护或非活化的糖作为糖基供体，因此，广泛用于酶促糖苷化反应合成各类糖基化合物。目前国内外糖基化合物的研究热点主要是黄酮衍生物的合成，但是由于大多数黄酮苷元及其黄酮苷类在水相中溶解度低，限制了其制剂的开发。已报道的黄酮类化合物的糖苷化反应主要是采用植物细胞、微生物和游离酶的生物转化。植物细胞中含多种酶系，因此以植物细胞进行生物转化的糖基化位置较多，糖基化产物也相对复杂；且底物在植物细胞悬浮液中溶解度会更低，影响产率。以微生物细胞进行的生物转化由于底物溶解度等问题通常产率也较低。比较多的报道是关于国外采用基因工程技术改造生成糖基转移酶用于黄酮类物质的糖基化作用，但是这种方法无法改善底物溶解度低的问题，故产率依然很低。非水相反应可解决酶催化反应时底物溶解度低的问题。

传统的酶催化反应主要在水中进行，但随着对酶的深入研究，发现酶反应在非水相介质中具有许多水相不具备的优势，如增加非极性底物的溶解性，通过控制反应平衡移动的方向极大地提高产率等。近年来，有关在有机介质中的酶催化反应研究是酶工程中一个活跃的领域，耐有机溶剂葡萄糖苷酶的应用前景更为广阔。目前国内外关于耐有机溶剂产糖苷酶菌株的报道比较少，还未见有关于地衣芽胞杆菌产耐有机溶剂糖苷酶的报道，且此菌株糖基化槲皮素生成槲皮苷的产量较高，优势较为明显。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种耐有机溶剂的产葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)BBE11-1，可应用于食品工业、药物合成、饲料加工。

所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)BBE11-1于2011年9月18藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011319。

所述地衣芽胞杆菌初始发酵用培养基组成如下：可溶性淀粉5g/L，蛋白胨25g/L，酵母粉3g/L磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH自然。

所述地衣芽胞杆菌的最佳产酶培养基为：蔗糖7.5g/L，胰蛋白胨25g/L，酵母粉4.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.250g/L。

本发明提供的菌株，具有在耐二甲基甲酰胺特性并且葡萄糖苷酶活性较高，为国内首例有关α-葡萄糖苷酶的地衣芽胞杆菌菌株；采用本发明所筛选的菌株对槲皮素进行糖基化反应，经分析后可以产生至少一种糖基衍生物；采用本发明筛选的菌株发酵12小时的葡萄糖氧化酶活最高达到227.8U L^-1，转化率达到14.81％，槲皮素产量达到0.148g L^-1，转化率远远高于国内有关槲皮素糖基化的报道。

具体实施方式

实施例1产葡萄糖苷酶菌株的初筛筛选方法

1.样品来源为无锡当地化工厂附近的土壤，取适量土样放入含无菌水和玻璃珠的三角瓶中，置37℃摇床混匀、打碎做成菌悬液；

2.将菌悬液加入到初筛培养基中，37℃200rpm，培养24h；

初筛培养基(LB)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，DMF10％.pH自然；

3.将菌悬液过滤稀释成10^-4、10^-5、10^-6 3个稀释度涂布LB平板。涂布后37℃培养24h；