[发明专利]一种敲除牛MSTN基因的打靶载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及生物技术领域，涉及一种启动子捕获型打靶载体，具体地，涉及一种敲除牛MSTN基因的启动子捕获型打靶载体及其应用。

背景技术

肌肉生长抑制素(MSTN)是特异性骨骼肌生长发育负调控因子，其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，牛MSTN基因的自然突变会引发“双肌”现象。双肌牛比正常牛具有较高的瘦肉率和较好的肉质，且脂肪率低，口感良好，但国内现有品种中缺少“双肌”表型的牛。通过基因敲除技术构建了MSTN基因突变纯合体小鼠，发现并验证了生长抑素基因突变鼠的体重比正常鼠大30％，而且这种差异在成年鼠中不受年龄和性别的影响(McPherron A C，1997，Nature 387，83-90)。以双肌现象著称的比利时蓝牛(Beigian Blue)和皮德蒙特牛(piedmontese)就是MSTN基因发生自然突变。比利时蓝牛MSTN基因序列中的第3个外显子上缺失了11个核苷酸，是导致MSTN基因阅读框发生移位，使MSTN被截短，不能发挥其生物的活性；皮尔蒙特牛则是由于第3个外显子发生了错误突变，导致了在成熟蛋白区内酪氨酸代替了保守的半胱氨酸，而在第1个外显子也发生了突变，造苯丙氨酸代替了亮氨酸，起结果均使肌肉生成抑制素的功能全部或者几乎全部丧失(Kambadur R，1997，Genome Res 7(9)，910-916)。

MSTN基因的发现，为生物育种工作者提供了新的思路。但是，育种工作者利用现有的双肌动物进行繁育存在育种速度慢和杂交性状不稳定等问题。2000年，McCreath等利用体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞进行COL1A1基因的定点突变，并利用定点突变成功的细胞作为体细胞克隆的核供体，已经成功获得基因定点修饰的活的小羊，这为家畜类动物的基因修饰提供了有效的途径(McCreath，2000，Nature 405，1066-1069)。另外，研究表明，在体细胞中进行基因打靶，启动子捕获型打靶载体的效率比传统的有启动子打靶载体联合正负筛选策略的效率高出100倍左右(Waldman A S，1992，Crit Rev Oncol Hematol 22(1)，127-128)。

目前，在家畜MSTN基因敲除研究方面，国内外在载体构建方面做了大量的研究工作，获得了一些MSTN基因敲除细胞系。但动物出生的报道相对较少，其中利用启动子捕获型载体进行MSTN基因突变的就更加罕见。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体；本发明的另一个目的在于提供该启动子捕获型打靶载体的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是从和牛耳部组织中提取牛的基因组DNA，根据Genebank报道的牛MSTN基因序列设计长短同源臂引物，通过PCR方法从基因组DNA中克隆同源臂，将同源臂分别克隆到表达载体，经过限制性内切酶酶切和测序分析确定同源臂的准确性后，采用酶切和连接的方法将长短同源臂分别连接到基础载体PIII中，最后通过限制性内切酶酶切鉴定同源臂连接的正确性，构建获得一种敲除牛MSTN基因的启动子捕获型打靶载体PIII-MSTN(构建过程参见图1)。

MSTN基因的核苷酸序列在进化过程中高度保守，包括3个外显子和2个内含子，其中第三个外显子是它的成熟区；牛的MSTN基因位于2号染色体的近着丝粒端距离TGLA44(微卫星标记，ms)3.1cM的位置，包括6691个碱基，3个外显子分别位于10134～10506、12335～12708和14741～15121位置上。基础载体PIII包含一个不含启动子的绿色荧光蛋白EGFP基因和一个含自身启动子PGK的新霉素抗性基因(Neo^r)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明提供的启动子捕获型打靶载体为PIII-MSTN，包含MSTN基因长短同源臂3’同源臂和5’同源臂，PIII-MSTN载体中的MSTN基因同源臂序列能够靶向性界定并敲除基因组上的靶基因。所述的5’同源臂不包含MSTN基因自身启动子的全部序列，且最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基。

所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO：1的8834～10133；3’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO：1的15091～21957。