[发明专利]一种植物悬浮细胞的固定化修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物悬浮细胞的固定化修饰方法。

背景技术

原子力显微镜(AFM)因为具有较高的空间分辨率和力学灵敏度，使其在诸多领域得到了广泛的应用，同时在生物学领域也得到了极大的发展。近年来，AFM的高分辨成像和单分子测力在对生物大分子和细胞膜超微结构和动态结构表征以及DNA、抗体-抗原、药物和生物分子之间的相互作用力等方面有了较深入的研究。但是，关于AFM在活细胞上的研究大多局限于动物贴壁细胞，植物悬浮细胞及其原生质体由于悬浮生长的特殊的存在状态，而又缺乏合适的固定悬浮细胞的方法，使得活细胞水平上关于细胞表面的结构、功能、粘性和弹性以及小分子之间的相互作用力等的研究手段非常局限，这也束缚了相关研究的进展。目前比较常用的是荧光显微镜，如GFP染色等，AFM在悬浮生长细胞的研究上受到了极大地限制，使得悬浮细胞在结构和相关功能上的高分辨的研究并不多。因此，发展一种将悬浮细胞固定化修饰的方法具有重要的意义，同时也可以为其它相关的研究提供思路。

目前，有多篇文献报道了悬浮细胞的固定方法，如多聚赖氨酸交联、微量移液管口捕捉、小孔径滤膜截留法等，但是这些方法均存在不同程度的缺陷。在动物细胞实验中，多聚赖氨酸仅作为一种辅助交联手段用于增强不易贴壁或半贴壁细胞的贴壁效果，用于固定悬浮的细胞，效率较低，且贴壁效果不好。而微量移液管口捕捉、小孔径滤膜截留等方法对细胞表面施加的作用力过大，对于植物细胞原生质体作用尤为明显，破坏了生物细胞正常的生理状态，难以实时反映细胞结构、功能的真实状况。因此有必要发展一种具有操作简便，细胞贴壁性好，生物活性受影响小，近生理环境等优势的悬浮细胞固定化修饰方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种固定悬浮细胞的方法。

该方法为将悬浮细胞与基底材料交联，使二者表面的基团间形成化学键，得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。该方法中首先通过分子间反应：羧基与碳化二亚胺形成不稳定的酯过渡态，再与N-羟基亚胺生成一种半稳定的处于活化状态的亚胺酯，可与基底表面修饰的氨基生成更稳定的酰胺键从而将悬浮细胞捕获到修饰有氨基的基底表面。

在上述方法中，所述将悬浮细胞与基底材料交联的方法具体包括如下步骤：

1)分别活化所述悬浮细胞和所述基底材料，得到活化后悬浮细胞和活化后基底材料；

2)将步骤1)得到的活化后悬浮细胞与活化后基底材料反应，即得到固定在所述基底材料上的悬浮细胞。

在上述方法中，步骤1)中，所述活化所述悬浮细胞采用的活化剂为EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)或其盐酸盐形式和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)或其衍生物形式，所述EDC的其盐酸盐形式为EDC-HCl(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，所述NHS的衍生物形式具体为Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)；

本发明的实施例活化所述悬浮细胞具体用的是EDC-HCl和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)；

上述活化基底材料采用的活化剂为硅烷化试剂，所述硅烷化试剂具体可为APTES((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)或MPTMS(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，本发明的实施例具体用的是APTES((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)；

步骤2)中，所述反应的温度为26℃，所述反应时间为10min-2h，所述反应时间具体为2h，所述反应为静置、避光反应。

在上述方法中，步骤1)中的活化悬浮细胞的方法包括如下步骤：

A、将悬浮细胞溶液与所述EDC-HCl混匀，得到混合液；

B、再向步骤A得到的混合液中加入所述Sulfo-NHS混匀，反应，即得到活化后的悬浮细胞；

其中，悬浮细胞溶液按照如下方法制备：将所述悬浮细胞在培养基中培养3天，得到悬浮细胞溶液，所述悬浮细胞在所述悬浮细胞溶液中的浓度为2.36×10³个/ml；

上述悬浮细胞的培养为避光培养，所述培养温度为26℃，所述培养采用的转速为120rpm；

在上述方法中，步骤1)中的活化基底材料的方法包括如下步骤：

C、将所述基底材料经Plasma处理，得到处理后基底材料(表面羟基化)；

D、将步骤C得到的处理后基底材料浸入含有APTES的甲苯溶液中，反应，即得到所述活化后基底材料。