[发明专利]人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种临床检验技术的方法学改进，采用特异性反转录(reverse transcription，RT)引物，反转录人白血病融合基因BCR-ABL编码的p210蛋白的mRNA，包括ABL激酶区序列在内的长度1.5kb的片段。可以显著提高了RT-PCR的扩增成功率。

背景技术

慢性粒细胞白血病CML是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。95％的CML患者异常白细胞中含有一段染色体易位形成的被命名为“费城”的异常染色体。其形成机理为9号染色体的一段拼接到了22号染色体上，这种拼接形成了一个新的异常的具有致癌效果的基因BCR-ABL。BCR-ABL基因的编码蛋白具有异常的酪氨酸酶活性，使调控细胞复制的信号传导途径一直处於活跃状态，从而源源不断地产生更多的异常白血细胞，骨髓正常控制的白血细胞的生成被破坏，形成CML病症。

各国CML的发病率相对一致，约为1-2人/10万。在儿童中，CML的发病率极低，所占比例不超过儿童白血病的5％，成人中，CML占所有成人白血病的15％。CML病人在诊断后两年内的死亡率为20％到30％，而后每年25％的病人死亡，他们在确诊后的平均存活年数只有三到五年。CML大致可分为三个阶段：慢性期，加速期和暴发期。从初发阶段到暴发期，骨髓内异常细胞数目一直上升，而且扩散至骨髓外。慢性期可潜伏4到5年，在这一阶段，患者症状很轻，往往只在例常的血检时才被检测发现。加速期在6到18个月之间，这时白血球的扩增往往已难用常规疗法控制。而在最后的暴发期，患者只能存活1到6个月。

格列卫是一种新型的治疗CML的小分子化学药物，活性成份为甲磺酸伊马替尼，广泛用于治疗慢性髓性白血病(CML)急变期、加速期或α-干扰素治疗失败后的慢性期患者。它直接定靶于导致CML的异常酪氨酸激酶BCR-ABL，通过抑制这个酶的活性从而抑制更多的癌细胞的产生，同时它能诱导已生成的癌细胞的凋亡。这种定靶的专一性使它的治疗效率提高和副作用大大减小，95％的病人在服药一到三个月之后就可见到药效，癌细胞减少，血细胞数目可回到正常值。

研究发现对处于CML暴发期的病人，格列卫先有作用，而后疾病可能复发。据估计，大约有5％至10％的处在慢性阶段的病人会对格列卫产生抗性，并且如果在较晚阶段才开始治疗CML，这个百分比则更高。其原因可能是因为BCR-ABL融合基因ABL激酶区序列发生突变，导致BCR-ABL蛋白发生变异，构象变化，格列卫不再能与变异的蛋白结合来抑制其活性。约80％的耐药是由于BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶区突变引起的，已报道的突变超过50种。

目前发现的ABL激酶区突变主要集中于ATP结合区(P环，第244～255氨基酸)、T315、M351及活化区(A环)四个区，不同突变位点引起的耐药程度不同。部分突变患者可以对新型的激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib，BMS-354825)或尼罗替尼(Nilotinib，AMN 107)有治疗反应，可作为格列卫的替代用药。发生于P环的突变耐药性强，如G250E、Y253H及E255K等突变耐药程度都很高。目前报道的突变中，尤以T315I耐药程度最高，是惟一报道对所有激酶抑制剂都耐药的突变。这些高度耐药的突变预后差，需尽早改用其他治疗方案。而M351T、E355G、M244V等耐药程度不高，可以通过提高剂量来抵抗耐药。因此，在用格列卫化疗前对患者的融合基因ABL激酶区进行测序，可以有效地为综合定量监测和格列卫耐药突变等情况做一个评估，根据每位患者的病情和疾病的发展，进行精确的个体化治疗。

Sanger测序法是目前公认的，运用于大多数临床分子诊断项目的金标准，其特异性达到100％，是分子准段赖以开展的经典技术平台。因此用采用Sanger测序法对BCR-ABL融合基因编码产物的激酶区序列进行突变检测，具有稳定可靠，特异性好的优点，可有效避免假阳性的发生。

为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目特点，建立一个稳定可靠的RT-PCR体系。该项目的RT-PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液白细胞中的mRNA，由于临床标本物流运输中存在着众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量优良的全血样本，因此获得的mRNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于融合基因拼接点离需要检测的ABL激酶区较远，因此RT-PCR需要扩增的片段较大，约有1.5kb，故对反转录的过程要求较高。