[发明专利]在油包水乳液中制备的交联酶聚集体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及在油包水乳液中制备的交联酶聚集体及其制备方法。

背景技术

固定化酶与游离酶相比稳定性高、易从反应系统中分离、能重复使用、利于实现自动化生产，获得性能优异的固定化酶对实现工业环境下酶的高效利用，促进生物催化产业的快速发展具有重要意义。

酶的固定化方法根据是否需要载体可分为载体固定化法和无载体固定化法。载体固定化法由于惰性载体的引入，“稀释”了酶的活性(在整个固定化酶重量中，载体一般占90％以上)，并且载体通常会影响底物和产物的扩散，所得固定化酶的单位酶活低。其次，有些载体比酶更昂贵，如Eupergit系列、碳纳米管等，制备费用高。还有，一些载体稳定性差或具有毒性，易污染产品。因此，尽管研究人员在载体固定化方法的改进及新型载体的开发上作了许多工作，但真正投入工业化应用的尚不多。

近年来，出现了一种无载体固定化酶的方法一交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates)技术，该法最先由荷兰Delft理工大学的Sheldon小组提出，其原理为：向酶液中添加盐、有机溶剂、非离子聚合物等沉淀剂，可以使酶蛋白通过非共价键形成超分子结构-不溶性的物理聚集体，然后再利用交联剂对聚集体进行共价捆绑，就得到交联酶聚集体，其结构和活性在反应体系中不易被破坏，可被回收重复使用。利用交联酶聚集体技术可以提高酶对有机溶剂的耐受性，调控酶的功能，并且可同时对多种酶联合固定化。与载体固定化法相比，交联酶聚集体技术所得固定化酶单位酶活高，例如商品化的Eupergit C固定化青霉素酰化酶活力为100U/g，而青霉素酰化酶的交联酶聚集体的酶活高达9875～12440U/g〔Cao L.van Langen L M，van Rantwijk F，Sheldon R A.Cross-linked aggregates of penicillin acylase.robust catalysts for the synthesis of β-lactam antibiotics.Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic，2001，11(4-6)：665-670〕，这样应用时使用较小的反应器即可，投资和操作费用低。此外，与另一种无载体固定化法-交联酶晶体(CLEC)法相比，交联酶聚集体技术对酶的纯度要求不高，不需要结晶等复杂步骤，制备简便。

但是Sheldon小组建立的方法是在溶液中构建交联酶聚集体，所得交联酶聚集体成团成簇，不易分散，呈无定形的集簇状，尺寸较大，存在明显的传质问题，影响交联酶聚集体充分发挥活性。

发明内容

为解决上述技术中存在的不足，本发明的目的是提供在油包水乳液中制备的交联酶聚集体及其制备方法，该交联酶聚集体具有较规则的形状，近似球形，单位酶活高。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种在油包水乳液中制备交联酶聚集体的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：配制酶溶液；

步骤2：于酶溶液中加入可以使酶聚集沉淀的沉淀剂，制备含有酶的分散相；

步骤3：将步骤2中含有酶的分散相分散于疏水性液体中，形成油包水乳液；

步骤4：用交联剂交联油包水乳液中的酶聚集体；

步骤5：回收形成的交联酶聚集体。

其中所述的酶可以是任何酶或不同酶的组合物，例如蛋白酶、脂酶、青霉素酰化酶、脲酶、果胶酶、乳糖酶、海藻糖合酶、葡萄糖异构酶、半乳糖苷酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、漆酶、植酸酶、有机磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、拟除虫菊酯水解酶和它们的组合物。

所述的沉淀剂是指可以使酶通过非共价键形成聚集体而沉淀的物质，例如硫酸铵、硫酸钠等盐类，丙酮、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乳酸乙酯等有机溶剂，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖等非离子型聚合物。

所述的疏水性液体包括矿物油、植物油等油类，己烷、庚烷等碳氢化合物，二辛醚、二苯醚等醚类化合物以及三酸甘油酯、棕榈酸异丙酯等酯类化合物。

所述的交联剂是能与所选的酶交联的双功能或多功能基团试剂，可以选自醛类，例如戊二醛、乙二醛、丁二醛、葡聚糖聚醛(dextran aldehyde)，异氰酸酯，例如六亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯，环氧化物，有机卤化物，酸酐，偶氮化合物等。